生命科学   2021, Vol. 33 Issue (12): 1520-1531.  DOI: 10.13376/j.cbls/2021171.
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管宁子, 尹剑丽, 王义丹, 余贵玲, 叶海峰. 合成生物学在慢病防治领域的应用与展望. 生命科学, 2021, 33(12): 1520-1531. DOI: 10.13376/j.cbls/2021171.
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GUAN Ning-Zi, YIN Jian-Li, WANG Yi-Dan, YU Gui-Ling, YE Hai-Feng. Application and prospect of synthetic biology in the prevention and treatment of chronic diseases. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2021, 33(12): 1520-1531. DOI: 10.13376/j.cbls/2021171.
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基金项目

国家重点研发计划项目(2019YFA0904500);国家自然科学基金项目(31971346,31861143016,31901023)

作者简介

叶海峰,华东师范大学二级教授、博士生导师、生命科学学院副院长、国家重点研发计划首席科学家、国家高层次人才入选者。任教育部科技委交叉科学与未来技术专门委员会委员,中国生物工程学会理事。2007–2013年在瑞士苏黎世联邦理工学院(ETH Zurich)从事博士和博士后研究工作。2013年被授予ETH Zurich最高荣誉奖章。主要从事医学合成生物学研究方向,研究内容包括智能细胞药物设计构建、光遗传学工具开发、精准可控的肿瘤免疫治疗、药物工程菌设计改造等。相关研究成果以第一或通讯作者身份发表在ScienceSci Transl MedSci AdvNat BiotechNat Biomed EngNat CommunProc Natl Acad Sci USA等期刊 。

通信作者

叶海峰:E-mail: hfye@bio.ecnu.edu.cn;Tel: 021-54341058

文章历史

收稿日期:2021-11-08
合成生物学在慢病防治领域的应用与展望
管宁子 , 尹剑丽 , 王义丹 , 余贵玲 , 叶海峰
(华东师范大学生命科学学院,上海市调控生物学重点实验室,华东师范大学医学合成生物学研究中心,上海 200241)
摘要:随着合成生物学各项技术的日益完善和遗传元件的逐渐丰富,越来越多的基于不同响应机理、不同逻辑运算的人工基因线路被陆续设计开发。基于人工基因线路的定制化细胞疗法和基因治疗极大地推动了重大疾病的创新治疗策略并显示出巨大潜力。然而,目前基因线路定制细胞的设计与构建仍主要依靠假设-试错循环的经验性方法。如何设计与构建智能化、自动化的定制细胞和基因线路以满足不同实际应用场景需求是目前亟需解决的瓶颈问题。未来的合成生物学发展,将利用蛋白质定向进化技术、人工智能化技术在解析底盘细胞生命活动分子机制的基础上,设计动态化感知的智能化基因线路,有效地保证癌症、代谢疾病等治疗的安全性、高效性和特异性。
关键词合成生物学    基因线路    定制化细胞疗法    基因疗法    噬菌体疗法    
Application and prospect of synthetic biology in the prevention and treatment of chronic diseases
GUAN Ning-Zi , YIN Jian-Li , WANG Yi-Dan , YU Gui-Ling , YE Hai-Feng     
(Biomedical Synthetic Biology Research Center, Shanghai Key Laboratory of Regulatory Biology School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China)
Abstract: With the improvement of synthetic biology technology and the enrichment of genetic elements, more and more synthetic genetic circuits based on different response mechanisms and logic computations have been designed and developed. Customized cell therapies and gene therapies based on synthetic genetic circuits have greatly driven innovative treatment strategies for severe diseases and show great potential. However, at present, the design and construction of customized cells with genetic circuits mainly rely on the empirical methods of hypothesis-trial-error cycles. How to design and construct intelligent and automated customized cells and genetic circuits to meet the requirements of different application scenarios is a bottleneck that needs to be solved urgently. In the future development of synthetic biology, protein directed evolution and artificial intelligence technologies will be introduced to design intelligent genetic circuits with dynamic sensing on the basis of analyzing the molecular mechanism of chassis cells life, so as to effectively enhance the safety, efficiency and specificity of therapies for cancer, metabolic diseases and so on.
Key words: synthetic biology    genetic circuits    customized cell therapies    gene therapies    phagotherapy    

现代生物医学技术在疾病诊断、治疗、预后、康复及大健康防控与干预等领域面临诸多挑战,存在较多难以突破的瓶颈。合成生物学作为新的关键技术将在医学及制药领域具有广泛的应用前景并将产生深远影响。合成生物学在DNA合成与组装、人工基因线路的工程化、无细胞及全细胞的非天然核苷酸和氨基酸合成、生物大分子的高效安全递送等新一代基因表达干预技术方面的突破,使得识别整合多个疾病信号,编程宿主细胞,并对其功能进行修复和优化成为可能,达到干预和治愈疾病的目的。

合成生物学已经在药物发现及医学研究工具的开发,天然产物的高效生物合成,针对重大疾病治疗药物的人工绿色智造,非天然核苷和氨基酸人工合成与生产,基于微生物的疾病诊断与治疗,细胞类药物的设计、改造、生产与疾病治疗,人工大器官的改造与制备等领域取得了积极的进展,并展现出化学小分子或大分子生物药物过渡到与“活体”药物互补并存的局面。

随着对人类基因组研究的不断深入,已知基因表达调控并非孤立、单一事件,涉及到复杂的信息网络与许多信号分子的相互作用[1]、相互制约和影响[2]。近十余年中,合成生物学、生物信息学,以及人工智能快速发展,合理设计具有预期功能的高效人工基因回路取得了长足进展。合成生物学技术能将相关分子部件工程化、模块化,并进行理性设计、改造、重建,可对细胞的复杂行为进行编程调控,实现有效的人工可控基因表达[3-4],被认为是引领生物科技产业第三次革命并将推动第五次工业革命的新学科。目前合成生物学已经在多个应用领域取得了重大进展[5-7]。早期阶段合成生物学主要包括设计和构建一些基因拨动开关[8]、振荡器[9-10]、定时器[11-12]、计数器[13]、模式检测器[14]和细胞通讯系统[15]等。随后,一些开创性实验证实了合成生物学用于疾病治疗的可能性,为现代医学带来了新的思路和策略。迄今,合成生物学在医学领域的发展已崭露头角,推动了肿瘤、糖尿病等疾病的治疗发展[16]

1 基于合成生物学的疾病诊疗(图 1)
图 1 基于合成生物学的疾病诊疗发展现状
1.1 定制细胞疗法

目前,以人工定制细胞为基础的细胞疗法作为一种里程碑式的新型治疗手段,突破了传统手术和药物治疗的局限,为癌症等疑难疾病提供了全新的治疗思路和途径,可以根据患者的实际病情实时反馈疾病相关的生物标记,并以此为命令快速开启药物的合成与释放,使其具有特定的治疗功效,从而实现疾病的精准个性化治疗。

1.1.1 微生物细胞疗法

在人体口腔、肠道等部位存在大量微生物,可帮助人体抵抗病原体的侵蚀,并促进人体免疫系统的完善[17]。美国国立卫生研究院资助的人类微生物群项目(HMP)和欧洲人类肠道宏基因组计划(MetaHIT)实施以来,人们对微生物群及其与健康和疾病的关系的了解呈指数级增长,围绕这一领域市场规模正在飞速发展壮大。合成生物学技术可以提高微生物的可控性与有效性,极大地促进了其在疾病诊疗中的应用。

代谢性疾病治疗成本高、疗效差,且无法治愈,过程痛苦。经过改造的工程微生物可以定植于患者的消化道中,长期持续地缓解患者的症状。通过在乳杆菌中融合表达金枪鱼框架蛋白和黄鳍框架蛋白可以合成血管紧张素转化酶抑制肽,从而有效降低高血压大鼠的收缩压、内皮素和血管紧张素II的水平[18]。在乳酸乳球菌中表达HSP65-6P277融合蛋白,可以显著提高非肥胖糖尿病小鼠的葡萄糖耐受性,并减少胰岛炎的发生[19]。在乳酸菌中表达各种形式的GLP-1,对2型糖尿病具有治疗效果。产N-酰基磷脂酰乙醇胺的大肠杆菌(EcN)工程菌可以预防小鼠肥胖,并治疗果糖引起的小鼠脂肪肝和缺铁[20]

由于多种厌氧菌会有倾向性地在实体瘤中繁殖,可用作抗癌药物的载体。采用合成生物学方法可提高微生物靶向肿瘤和载荷药物的能力。减毒的沙门氏菌经改造表达细胞凋亡相关基因fadd、细胞因子如干扰素-γ或来自创伤弧菌的鞭毛蛋白B可用于肿瘤杀伤或免疫治疗[21-23]。群体感应系统、水杨酸调控组件等也被引入沙门氏菌以控制抗肿瘤药物的表达与释放[24-25]。大肠杆菌被设计识别实体瘤细胞中的葡萄糖,以此为药物载体能够更好地定位和杀死癌细胞[26]。工程化的大肠杆菌与十字花科蔬菜的联合使用,能够定位到癌症发生部位,并通过分泌黑芥子酶将十字花科蔬菜的活性物质催化形成抗癌制剂,从而预防并治疗结直肠癌[27]。长双歧杆菌在实体瘤中具有优异的定植和增殖能力,经改造表达肿瘤抑素可抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤内血管内皮细胞凋亡[28]

除此之外,微生物经过设计改造还可用于对抗病原菌感染[29]、治疗疟疾[30-31]、递送治疗性外源蛋白至宿主黏膜来治疗炎症[32]、预防和治疗过敏[33]、加快创伤愈合[34]等。利用微生物中的传感组件构建活体诊断剂也是工程化微生物的重要研究方向。在益生菌中改造噬菌体𝜆 CI/Cro双稳态开关检测连四硫酸盐或构建细菌来源的硫代硫酸盐感受器可实现肠炎的诊断[35];通过整合血红素响应的转录阻遏蛋白可以改造大肠杆菌检测肠道出血[36];构建全细胞生物传感器检测尿液和血液样本中的生理指标可实现炎症和糖尿病的诊断[37];Danino等[38]还利用EcN特异性靶向肿瘤的特性对其进行改造,实现了检测尿液诊断肝癌。总之,微生物为底盘在细胞治疗中具有显著的优势,越来越多的微生物被开发和改造用于疾病的诊断与治疗。

1.1.2 哺乳动物细胞疗法

真核细胞具有持续感知、整合和存储与机体状态相关的生理和生物信息的能力。真核细胞作为底盘细胞能够源源不断地产生蛋白药物、自动调节剂量和生物利用度、对机体进行个性化治疗。因此,越来越多的科学家关注于设计更适用于临床的哺乳动物转基因调控装置。

1.1.2.1 精准可控的活体细胞药物工厂

近年来,科学家开发出了一系列与疾病治疗相关的可控基因开关,它们可以通过感应外界的刺激或机体内的代谢信号,重新编程细胞行为,从而实现临床治疗的目的。四环素[39]、大环内脂类抗生素[40]和链阳菌素[41]等调控的基因开关是早期经典的化学物质调控系统,但由于以会对人体产生副作用的抗生素作为诱导剂,极大地限制了其应用范围。近期,科学家们开发了一些新的健康安全的小分子物质调控的基因开关并将其应用于疾病治疗,如咖啡因调控的基因开关用于治疗糖尿病[42];齐墩果酸调控的基因开关用于治疗肝源性糖尿病[43];降血压药物胍那苯调控的基因开关用于治疗代谢综合征[44];绿茶调控的基因开关用于治疗糖尿病[45]

由于光处理生物信息的非侵入性、瞬时快速、精确、高时空分辨率和可逆性的优势,光控的基因开关被陆续开发,在疾病治疗上具有极大的应用前景。笔者课题组先后开发了基于G蛋白偶联受体黑视素(Melanopsin)的蓝光调控的基因开关和基于细菌光敏蛋白BphS的远红光调控的转基因表达控制系统,可以通过光照调节胰岛素或GLP-1的分泌维持糖尿病小鼠的血糖稳态[46]。此外,光控基因开关还被开发用于神经系统疾病、肿瘤、心血管疾病、糖尿病、基因疾病的治疗[47]。相对于光,具有强穿透性的物理信号在疾病治疗上更具优势,因此微波和电调控的基因开关也先后被开发用于治疗糖尿病[48-49]

1.1.2.2 闭环式传感器设计与诊疗一体化

闭环式传感器是通过识别机体内的代谢物质,重新编程细胞内部的代谢活动,同时还具备反馈调节机制,从而实现诊治一体化。因此,越来越多的闭环式传感器被用于疾病的诊断和治疗,如尿酸传感器治疗痛风[50]、多巴胺传感器治疗高血压[51]、脂肪酸传感器治疗肥胖[51]、甲状腺激素传感器治疗甲亢[52]、细胞因子交换器治疗银屑病[53]、葡萄糖传感器改善1型糖尿病小鼠血糖稳态[54]以及胰岛素传感器治疗2型糖尿病[55]。2017年,笔者课题组将光遗传学、电子工程学、软件工程学相结合,开发了智能手机调控的工程化细胞,用于糖尿病血糖稳态控制[56]。这项工作将合成生物学、光遗传学与电子设备读取和产生高精度数字信号的能力相结合,开创了首个将全球医疗点技术、移动电子通讯技术和光控定制细胞药物相联合的移动医疗装置,为未来实现将基于细胞治疗的精准药物引入临床奠定基础。

1.1.2.3 人造免疫细胞治疗肿瘤

随着肿瘤学、免疫学和分子生物学的迅速发展及学科的交叉渗透,肿瘤免疫治疗研究日益深入,在肿瘤治疗方面展现了极大的应用前景,其中的研究热点为基因工程化T细胞过继性免疫治疗,主要包括基因工程化T细胞受体(TCR)和基因工程化嵌合性抗原受体(CAR)[57-58]。近几年来,通过过继传输可特异性结合特定抗原的CAR-T细胞技术、CAR-NK细胞技术和CAR-M细胞技术在临床抗肿瘤试验中取得了显著的疗效,引发了研究的新高潮[59]

科学家们利用合成生物学技术,开发出了基于synNotch受体的和门CAR-T细胞技术[60]、雷帕霉素调控的“ON开关”和“自杀开关”的CAR-T细胞技术[61]、四环素调控的“暂停开关”的CAR-T细胞技术[62]、调控T细胞增殖的核糖体开关[63]、HEK-T细胞技术[64]、TamPA-Cre (ERT2-CreN-nMag和NLS-pMag-CreC)蓝光系统[65]、基于CAR和嵌合共刺激受体CCR的和门技术[60]、基于细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1 (PD1)的抑制型CAR (iCAR)系统[66]和基于串联式scFv的或门CAR-T细胞技术[67]等,用于特异性识别并治疗肿瘤,大大地扩展了肿瘤免疫疗法的应用。2021年,本课题组把生物学的“开关”整合到了CAR中,利用红酒成分(白藜芦醇)有效地调控CAR-T细胞杀肿瘤[68],实现了CAR-T疗法的可控性,提高了肿瘤治疗的安全性。

与CAR-T细胞一样,CAR-NK细胞也用于治疗白血病、淋巴瘤和骨髓瘤,且可以有效抵抗B细胞恶性肿瘤活性[59]。2019年,夏建川团队开发了抗αFR-CAR改造的NK-92细胞,对αFR阳性卵巢癌具有较强的细胞毒性,为未来免疫细胞治疗卵巢癌的进一步临床研究发展奠定基础[69]。2021年,Rezvani团队将影响白细胞介素-15表达的关键蛋白和CAR-NK细胞巧妙地结合在了一起,极大地增强其抗淋巴瘤的能力[70]

由于巨噬细胞可以渗透实体肿瘤组织,并与肿瘤微环境中几乎所有的细胞成分(包括肿瘤细胞、免疫细胞如T细胞、NK细胞、DCs和其他驻留的非免疫细胞)相互作用,因此研究人员正在尝试使用CAR修饰的巨噬细胞(CAR- M)来对抗实体肿瘤[71]。2019年,南京大学沈萍萍团队设计了由靶向人类HER2的单链抗体片段、IghG1的一个铰链、小鼠CD147分子的跨膜和细胞内区域组成的CAR-147巨噬细胞,可显著抑制4T1乳腺癌[72]。2020年,Klichinsky团队采用靶向HER2的CAR对巨噬细胞进行改造,可以有效杀伤SKOV3人卵巢癌[73]

1.2 新型基因疗法

合成生物学通过使用人工基因线路干预肿瘤细胞或改造免疫细胞,开发革新肿瘤治疗方法,目前已取得巨大发展,多项研究成果有望应用于临床。

1.2.1 人工智能基因线路

溶瘤病毒(oncolytic virus, OVs)疗法是治疗肿瘤的新方法,被认为是肿瘤治疗领域的下一个重大突破点。OVs发展至今,已经历了多次更新,第一代仅具有肿瘤特异性,第二代具有肿瘤特异性且含有1个功能性外源基因的表达,第三代具有肿瘤特异性、免疫调节、免疫治疗功能和多个功能性外源基因的表达[74]

溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)的疗效由于先天免疫效应细胞快速清除病毒和瘤内病毒传播差受到限制。2019年,Yu研究团队设计了一种能够表达E-钙黏蛋白(CDH1)的oHSV,用于胶质母细胞瘤小鼠模型的治疗[75]。病毒基因组工程改造已可实现多样化基因元件的添加,能够利用肿瘤特异性启动子和microRNA调控溶瘤腺病毒复制。2019年,清华大学谢震课题组通过构建模块化的合成基因线路,调控溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中的选择性复制,提高了溶瘤病毒靶向肿瘤免疫治疗的效果和安全性[76]。Takeda团队将响应蓝光的Magnet蛋白定点分割后,分别插入病毒聚合酶的柔性结构域中,实现了溶瘤病毒的时空特异性复制,在乳腺癌小鼠模型中成功实现了光控溶瘤病毒抑制肿瘤生长[77]。2020年,研究人员对溶瘤病毒进行改造并与CAR-T细胞联合,在三阴性乳腺癌等多种实体瘤中发挥了作用[78]。武汉科技大学张同存团队把溶瘤病毒放进CAR-T细胞里,使其能精准地靶向并溶解实体瘤[79]。该项研究成果荣登2020“创世技”颠覆性创新榜。

近日,Humane Genomics公司基于合成生物学从“零”开始设计病毒,能够精确靶向癌细胞并装载抗肿瘤药物,以提高肿瘤杀伤能力或唤醒抗肿瘤免疫反应。其第一个溶瘤病毒疗法将用于治疗骨癌、肝癌、小细胞肺癌和胶质母细胞瘤。

1.2.2 基因编辑

自2013年CRISPR-Cas9技术首次实现人体细胞的基因编辑开始,CRISPR基因编辑技术便在医学领域有着不容小觑的发展潜力。科学家们希望利用基因编辑技术修复致病基因,消除疾病。CRISPR基因编辑技术在杜氏肌萎缩[80]、血友病[81]以及神经退行性疾病[82]等中都取得了良好的治疗效果。一些基于基因组编辑技术的临床试验目前正在如火如荼地展开,相关报道也展示了它们良好的治疗效果。美国生物科技公司Editas与制药公司Allergan联合开展了通过AAV递送CRISPR体内敲除CEP290突变内含子的方式治疗先天性黑朦10 (LCA10)的1/2期临床试验。在国内,以北京大学为首的多个研究团队采用CRISPR/Cas9技术对成体造血干细胞HSCs进行基因编辑,首次完成基因编辑干细胞治疗艾滋病和白血病患者[83]。经基因编辑CCR5突变的HSCs同种异体植入患有艾滋病合并急性淋巴细胞白血病的患者中,急性淋巴母细胞性白血病的症状仅在移植后4周就得到了完全缓解。目前有多项基于基因编辑的临床试验处于前期研究阶段,未来有希望获批用于更多疾病的临床治疗。

利用CRISPR系统的标准化模块,一些基于CRISPR系统的基因线路近年来被不断开发出来并用于记忆储存、生物计算机、疾病诊断等各个方面。例如2016年,Lu课题组构建了一个基于CRISPR-Cas9系统的记忆储存装置,能将事件的发生记录在细胞的基因组DNA中[84]。Qi团队利用诱导型的dCas9-TF系统构建了一组可实现多基因上调和下调的逻辑门等[85]。在疾病诊断方面,2018年张锋团队开发了CRISPR-Cas13分子诊断技术,又名SHERLOCK技术,可以快速、便捷诊断埃博拉、拉沙、寨卡病毒、登革热等RNA病毒的感染[86]。同年,Doudna团队开发出一种被称为“DETECTR”的诊断系统,可用于对临床样本中的少量DNA进行快速、简便的即时检测。“DETECTR”被证实可以准确测定出高风险的HPV类型:HPV16和HPV18[87]。在肿瘤识别杀伤方面,2014年,蔡志明团队利用CRISPR-Cas9标准化模块成功构建了能在体外特异识别并杀伤膀胱癌细胞的逻辑“与”门基因遗传线路[88]。该遗传线路能特异性区分膀胱癌细胞和其他类型细胞,并有效减缓肿瘤细胞的生长速度,诱导其自我凋亡,或遏制其迁移运动能力。Liu等[89-90]利用CRISPR-Cas9系统构建“与门”基因线路,实现对肿瘤细胞特异识别,实现细胞内复杂信号系统与命运的重编程,构建具有高效AAV病毒装载效率和治疗潜力的“CRISPRreader”基因线路。随着基因元件性能的提升,以及对肿瘤进展机制的进一步解析,肿瘤治疗方法将不断涌现和提升。目前,全球首款利用合成生物技术开发的肝癌治疗产品已获得美国FDA临床试验许可。

1.2.3 新型递送技术

随着生物技术的不断发展,基于合成生物学开发的基因线路得以运用到人类相关疾病的治疗之中。然而,如何将基因线路准确地引导至作用靶点,确保治疗的安全性和有效性,实现个性化精准治疗,是目前科学家们面临的重大难题。

1.2.3.1 人工定制化类病毒

上海交通大学蔡宇伽和洪佳旭研究团队将基因编辑和递送技术相融合,利用mRNA茎环结构与噬菌体衣壳蛋白特异识别的原理,创造了一种通用型、瞬时性的递送载体——类病毒体-mRNA (VLP-mRNA)[91-92]。利用该递送技术,该团队进行了CRISPR基因编辑治疗病毒性角膜炎的临床前研究。该技术是我国首个完全自主开发的原创型基因治疗载体,体现了我国在基因治疗领域的科技进步。2021年,研究人员利用哺乳动物逆转录病毒样蛋白PEG10包裹自己的mRNA,假型化完成mRNA递送[93]。通过在PEG10胶囊上设计融合原(fusogens),使其能够靶向到特定的细胞、组织或器官,最终实现SEND货物的运送。SEND系统由体内自然产生的蛋白质组成,可能不会触发免疫反应。cell free系统和脂质体的结合研究是人造细胞的基础,可以规避细胞致瘤性、免疫原性等风险。2017年,Adamala等[94]将脂质体和Cell Free系统相结合,设计合成了人造类细胞Synells (synthetic minimal cells),当导入特定的基因电路时,可以进行药物传递、细胞整合、信息交流等相对复杂的细胞活动。

2016年,Collins团队构建了基于RNA的Toehold开关,结合cell-free技术开创出体外基于纸片的合成基因线路,用于ZIKV的检测[95],并结合CRISPR/ Cas9基因编辑系统,依据病毒株之间单碱基的差异,完成病毒分型。该方法使得对病毒的检测更加简便、快速和准确。目前,COVID-19全球肆虐,亟需便携、快速的病毒检测方法。Collins团队发明了一种可检测病毒的口罩,可在90 min内准确检测出SARS-CoV-2病毒[96]。该技术的核心是利用合成生物学原理设计的一种可穿戴的冷冻干燥型无细胞生物传感器(wearable freeze-dried, cell-free sensor)。通过对基因线路的编辑,该传感器可以对不同的病毒、细菌、毒素和化学物质进行检测。

1.2.3.2 人工定制化材料

以“基因调控-工程设计”为核心的合成生物学技术从分子、细胞层面极大地推动了生命科学的发展,同时也为材料科学的发展注入新的思路和活力。

发现或创造更优性能的新材料一直是人类在科技进步中不断追求的目标之一。中国科学院深圳先进技术研究院钟超团队开发了一种新型的基于蛋白质的仿生超强水下黏合材料,首次将哺乳动物细胞中的低复杂序列蛋白应用于可控的功能生物材料领域[97]。未来,材料合成生物学的应用将非常广泛,包括水下黏合、活体建筑、清洁能源、生物医疗、水源修复、太空探索等等诸多领域。

2018年,Kojima等[98]开发的EXOtic (EXOsomal Transfer Into Cells)系统,可高效调控外泌体的合成和分泌,并包装特异mRNA靶向和释放到特定目标细胞,实现对疾病的治疗。2021年,斯坦福大学Bintu团队开发了一种利用纳米体招募靶标基因上的内源性染色质调控因子,可用于哺乳动物细胞的转录和表观遗传记忆调控[99]。该技术将纳米体与其他效应体结合来增强基因沉默,为服务于基因调控的基于纳米体的压缩工具的开发、鉴定和应用开辟了道路。

1.3 噬菌体疗法

噬菌体是地球上多样性最高和最丰富的生物体,是合成生物学研究中重要的模式生物。噬菌体被发现伊始,就被成功地用于细菌感染性疾病的治疗[100],但是抗生素的发现阻碍了噬菌体治疗更广范围的应用。目前,随着超级耐药菌的威胁日益严重[101],除控制抗生素的使用外,也亟需新的预防与治疗细菌感染的策略和手段,噬菌体治疗又重新受到重视[102]

2014年,噬菌体疗法被美国国家过敏与传染病研究所列为应对抗生素抗性的重要武器之一。应用噬菌体预防和治疗细菌感染具有独特的优势[103-104],如具有极高的宿主特异性,可识别特定的宿主细菌,对整个菌群的影响明显小于抗生素;能利用宿主细菌进行繁殖,效率高;在成功应用噬菌体治疗耐药菌感染的案例中,还未发现噬菌体对于人体有明显的副作用。噬菌体逐渐成为新型药物开发的研究热点之一。

噬菌体在预防与治疗细菌感染方面已取得了非凡的成果。早在2007年,Lu和Collins[105]改造T7噬菌体使其持续表达DspB蛋白,通过水解β-1, 6-N-乙酰基-α-葡萄酰胺(生物被膜胞外聚合物的重要组成成分)来瓦解细菌生物被膜,进而杀死被保护在生物被膜中的细菌。2019年,Yehl等[106]通过自然进化和结构建模,发现了T3噬菌体尾丝蛋白中的宿主范围决定区域,并通过定点突变和高通量筛选,最终获得了具有广泛宿主适用性的“合成噬菌体”。此外,设计改造噬菌体还用于加强抗生素抗菌疗效。部分抗生素可以破坏细菌的DNA,其引起的氧化压力致使细菌启动SOS响应的DNA修复系统。Lu和Collins[107]通过改造M13噬菌体使其表达LexA3,从而抑制细菌SOS应激机制的开启。因此,该工程噬菌体可显著增强喹诺酮类、β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素的杀菌效果。目前,多个国家有噬菌体治疗案例的发表[108]。近年来,国内也多有成功治疗案例的报道,如2018年采用噬菌体-抗生素联合治疗方案成功治愈了一例膀胱肿瘤术后的超级细菌感染者[109-110]

2 技术瓶颈与发展方向(图 2)
图 2 基于合成生物学理念的基因治疗和细胞治疗现有水平、技术瓶颈和未来发展方向

目前,由于无法在细胞植入人体后对细胞的行为和表型进行精确的时空控制,且外源植入的细胞(哺乳动物细胞)可能遭受免疫排斥,细胞(微生物)来源对于人类健康的影响尚不明确,细胞疗法还未能成为一项常用的治疗措施。另外,临床前研究依赖的动物模型很难完全复制人体的生理活动,且个体差异导致所需疗法的特异性等使得细胞疗法的相关研究进展缓慢。因此,未来需要进一步挖掘新的调控工具,提高细胞调控的精确性;开发合适的底盘细胞与移植方式,提高细胞发挥功能的安全性与长期性;建立智能细胞制造技术平台,实现细胞生产与细胞治疗的个体化、标准化、自动化、产业化。

由于繁殖快、易培养、成本低等特点,微生物作为底盘细胞用于疾病治疗具有极大的潜力,然而要实现其在医学领域的转化应用尚待进一步研究开发。多项细菌药物临床失败经验表明,细菌底盘的载药量无法满足患者的需求。如何平衡细菌安全用量与药物输出量是细菌药物亟待解决的关键问题。此外,药物的过度释放也具有一定的毒副作用,引入调控组件和分泌系统等控制环路可精准调控药物的合成与递送,提高其安全性。因此,开发精准可控的基因表达调控系统迫在眉睫。

要满足噬菌体的大规模实际应用,仍需要解决噬菌体本身的一些限制因素。经验证据显示噬菌体是安全的,但一些研究表明野生型噬菌体基因组可能含有毒力基因,因此噬菌体的应用可能有着不可预知的风险。此外,噬菌体具有较高的宿主特异性,且细菌极易对噬菌体产生抗性。噬菌体的最适应用条件,如最佳治疗时间、治疗剂量、治疗方式及细菌被裂解时的副作用都需要进行系统的研究来确定。为了规范噬菌体治疗方法,必须根据噬菌体产品的复杂性而更新监管策略。

人工基因线路要满足实际应用,仍需解决人工基因线路设计的一些局限性因素。作为重要的合成基因线路工具,利用CRISPR/Cas已开发出了大量基因元件,但外源Cas蛋白在人体中使用存在一定风险,其安全性和效率问题仍待解决。针对靶向控制肿瘤细胞死亡的理性设计,首先需要解析细胞死亡机制,开发相应元件精准控制肿瘤细胞死亡命运,明确细胞死亡与细胞增殖分裂等过程的耦合与反馈调节,阐释细胞死亡在肿瘤细胞代谢、基因组失稳、细胞间竞争、免疫逃逸和恶性进化等生物学过程中的关键作用与机制,合理性设计和优化智能抗肿瘤基因线路。靶向免疫系统的肿瘤治疗基因线路设计和构建的理论仍需不断尝试与创新以提高其靶向性和有效性,这就需要解析调控免疫细胞空间分布、命运抉择、抗原提呈以及识别杀伤的核心分子元件,解析其关键调控模块和信号回路,从而发展智能化的细胞识别和信号传递系统。

3 发展策略与前景(图 3)
图 3 医学合成生物学的发展策略与前景
3.1 人工智能驱动的人工生物元件、线路设计使能技术

建立医学人工基因表达调控元件的高通量功能分析方法和定向进化的优化方法,开发基于单细胞的医学人工基因表达调控元件、线路功能的定量分析和优化方法。开发一系列智能化、精准化可控的基因线路,发掘新的调控元件,构建新一代时空精准可控的细胞信号调控、基因表达、基因编辑、基因重组等一系列控制系统用于药物精准递送和疾病精准治疗。

3.2 人工基因线路智能化精准调控和递送技术

通过理性设计、蛋白质捕获技术、人工智能算法筛选,构建新型物理或小分子调控的基因线路控制系统。通过生物信息学、基于AI的机器学习以及蛋白质定向进化技术,构建模块简单、灵敏度高、诱导效率高等特点的新一代控制技术。构建绿色安全、经济便捷的触发式开关,提高患者治疗的依从性,降低治疗成本。开发瞬时性可控的基因编辑递送系统和具有细胞组织特异性、低免疫原性的病毒载体,及全人源非病毒载体的核酸递送系统。

3.3 人造智能细胞与疾病智能诊疗技术

开发精准可控、高效灵敏的基因调控环路和信息传感环路用于智能细胞的设计构建。构建药物快速释放精准调控系统,可快速释放药物,及时缓解或治疗病症。设计智能细胞机器人,可自动识别病灶并及时进行诊治。利用半导体合成生物学理念,建立成熟的有机生命体系与无机非生命体系相交融的超生命体系的超级智能精准控制体系,将智能细胞制造与电子信息软件工程技术相结合,实现细胞行为控制一体化、标准化、自动化、智能化,实现智能电子细胞药物技术平台用于疾病的超远程监控和实时自动给药的闭环诊疗模式。

3.4 肿瘤治疗智能免疫系统

通过解析其关键调控模块和信号回路,发展智能化的细胞识别和信号传递系统。在此基础上,设计构建以细胞因子、功能核酸作为信息元件的细胞间通讯系统;构建基于核酸分子运算回路的人工免疫细胞智能决策核心,实现人工免疫细胞的智能诊断和精准治疗;开发基于人工合成免疫细胞的智能增强型肿瘤免疫疗法。发展分子水平、细胞水平及组学水平的免疫细胞定量、定性表征技术,动态监测人工合成免疫细胞回输后的体内分布、循环、增殖、活性状态以及与单核巨噬细胞和MDSC等髓系免疫细胞相互作用研究;建立智能免疫系统设计、合成及优化的新理论,开发新概念、新功能、新病症的智能免疫系统药物。

3.5 精准控制肿瘤细胞死亡命运

首先通过探究生理、病理过程中的多种细胞死亡机制,鉴定调控细胞死亡的关键元件,解析细胞死亡与细胞增殖分裂等过程的耦合与反馈调节,构建细胞死亡机制激活与互作的功能学图谱与基因调控回路。开发基于纳米材料、病毒以及细胞等为载体的回路递送和激活技术,结合现代化的时空操控技术,实现对肿瘤细胞精准、高效、智能性杀伤或功能性死亡,革新肿瘤生物治疗策略,将有力推动肿瘤等难治性疾病的合成基因线路设计和优化发展,具有深远意义和广泛应用前景。

3.6 代谢性疾病的微生物代谢疗法

代谢性疾病的发生多是由于患者缺乏某些酶或激素引起的对某种物质的分解代谢缺陷。采用细菌等微生物为底盘细胞提高酶或激素等蛋白药物的量是目前治疗代谢性疾病的重要研究方向之一。从另一个角度出发,筛选或改造工程化微生物使其消耗患者体内过多的有害物质并转化为无毒的代谢物,是治疗代谢性疾病的又一重要策略。针对糖尿病、高血脂、高尿酸血症、苯丙酮尿症、高氨血症等代谢性疾病,筛选具有底物代谢能力的底盘微生物来重构代谢通路、加强代谢强度等,有望开发出具有临床应用价值的细菌药物。

3.7 人工噬菌体疗法

采用合成生物学方法和思路理性设计、合成人工噬菌体,提高病原菌检测敏感性,增强噬菌体的感染效率,拓展宿主谱及对抗细菌抗噬菌体抗性。挖掘噬菌体的功能基因元件,设计底盘噬菌体基因组,重构天然噬菌体或设计新型噬菌体,增强噬菌体在多重耐药菌感染治疗中的医学潜力。利用噬菌体的精准靶向性实现对菌群调控,开发有效的载体平台,高通量地将基因线路传递给特定细菌,精准调控微生物群落进行疾病治疗。深入研究噬菌体的基因多样性和功能多样性,开发噬菌体工程蛋白药物,设计和构建可能针对任何病原体的“量身定制的噬菌体蛋白制剂”。

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