生命科学   2021, Vol. 33 Issue (12): 1452-1461.  DOI: 10.13376/j.cbls/2021163.
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刘夏, 秦磊, 李春. 细胞工厂底盘抗逆属性的分子调控进展. 生命科学, 2021, 33(12): 1452-1461. DOI: 10.13376/j.cbls/2021163.
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LIU Xia, QIN Lei, LI Chun. Progress on molecular regulation of stress resistance properties for cell factory. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2021, 33(12): 1452-1461. DOI: 10.13376/j.cbls/2021163.
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基金项目

国家重点研发计划(2018YFA0901800);国家自然科学基金项目(21736002,21808013,22078171)

作者简介

李春,清华大学长聘教授,博士生导师,国家杰出青年科学基金获得者。长期从事代谢工程与合成生物学、生物催化与酶工程的研究,聚焦甘草萜烯类和黄酮类天然产物的酶转化与微生物合成、工业菌种智能抗逆分子设计与工程应用。在Metabolic EngACS Synth BiolACS CatalACS Energ LettNat CommunAIChE JChem Eng SciJ Biol ChemAppl Environ MicrobiolJ Phys Chem Lett等期刊发表论文300余篇,获授权发明专利36项,获省部级科技成果奖4项。国务院政府特殊津贴专家,全国“生物工程学”首席科学传播专家,获“侯德榜化工科技创新奖”。编著教材和专著11部章,其中主编的《合成生物学》和《生物工程与技术导论》已成为高校广泛使用的教材。现担任中国生物工程学会合成生物学专委会副主任、中国化工学会生物化工专委会副主任。担任《合成生物学》期刊执行主编,Front Bioeng Biotech副主编和Synth Systems Biotech、《化工进展》、《催化学报》、《过程工程学报》等多个期刊编委 。

通信作者

李春:E-mail: lichun@tsinghua.edu.cn

文章历史

收稿日期:2021-11-11
细胞工厂底盘抗逆属性的分子调控进展
刘夏 1, 秦磊 2, 李春 1,2
(1 北京理工大学化学与化工学院,生物化工研究所,医药分子科学与制剂工程工信部重点实验室,北京 100081)
(2 清华大学化学工程系,工业生物催化教育部重点实验室,北京 100084)
摘要:以微生物作为底盘细胞的绿色生物制造是化工制造领域的重要发展方向,是实现“双碳计划”和绿色经济的重要方式。微生物细胞工厂在工业应用中容易面临各种环境胁迫,影响细胞生长和产物合成,而维持最佳生产条件所需的高能耗和高成本制约了绿色生物制造的进一步发展。通过合成生物学手段改造底盘菌株,提高底盘菌株抗逆性是生物制造节能减排的有效途径。该文介绍了细胞工厂抗逆特性及其在生物制造中的产业化应用,并且综述了底盘细胞抗性的分子调控进展及改造策略。细胞工厂底盘抗逆属性的提升将推动绿色生物制造的发展,助力“碳中和、碳达峰”目标的实现。
关键词工业微生物    细胞工厂    抗逆    分子调控    “碳中和、碳达峰”    
Progress on molecular regulation of stress resistance properties for cell factory
LIU Xia 1, QIN Lei 2, LI Chun 1,2     
(1 Key Laboratory of Medical Molecule Science and Pharmaceutics Engineering, Ministry of Industry and Information Technology, Institute of Biochemical Engineering, School of Chemistry and Chemical Engineering, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China)
(2 Key Laboratory for Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China)
Abstract: Green biomanufacturing based on microbes as chassis cells is an important trend for the development of chemical engineering manufacturing, and is an important approach to realize the "dual-carbon plan" and green economy. Industrial applications of cell factories often face various environmental stresses that affect cell growth and production. The high energy consumption and high costs required for optimal production conditions restrict the further development of the green biomanufacturing. Engineering chassis strains through synthetic biology technologies is the effective way to improve the robustness of strains. This paper introduces the resistance properties and the industrial application of cell factory. The progress of molecular regulation in chassis cell resistance and modification strategies are summarized in depth. The improvement of stress resistance properties of cell factory chassis will promote the development of green biomanufacturing and help to achieve the goal of "carbon peak and neutrality".
Key words: industrial microorganism    cell factory    stress resistance    molecular regulation    "carbon peak and neutrality"    

随着全球能源危机和环境问题的日益严重,以破坏环境为代价、过度依赖化石等不可再生资源的发展模式成为大家重点关注的问题[1]。利用可再生和低CO2排放的生物原料,将绿色发展与“碳达峰、碳中和”的目标结合[2],发展可持续、可再生、安全可控的绿色生物制造,是解决化工产业“高能耗、高排放”,推动绿色可持续生产工艺的主要策略之一[3]

微生物作为底盘细胞为工业生物技术的发展提供优良的细胞工厂,有利于实现环境友好及可持续经济。工业微生物良好的生理性质,如代谢能力、鲁棒特性等对成功的生物制造起着至关重要的作用。常规的以代谢为导向的策略通常无法获得预期的表型,因为它只关注目标代谢功能,而忽略了微生物对环境胁迫的生理反应。为了应对燃料、化学物质、天然产物、大宗化学品等[4-5]的生物技术生产带来的新挑战,微生物除了需要具有强大的代谢能力外,还应发挥强大的鲁棒性和抗逆性,以使其能够在实际的生物转化过程中达到节能、减排、降耗、增效、提质的优良特性。构建自主响应工业环境变化,自行稳定生产性能优良、智能和高效的底盘菌株,可提高绿色生物制造的生产效率,降低发酵能耗和生产成本[6]。本文将从微生物细胞工厂特性、抗性分子机制与调控、抗逆底盘细胞改造方面对细胞工厂底盘抗逆属性的分子调控进展进行论述。

1 工业微生物与底盘细胞工厂 1.1 工业微生物的生产特性与抗逆属性

在工业生产中,使用微生物以廉价的碳源和氮源为底物生产有价值的化合物,可以为全球能源短缺、温室效应提供一种绿色、经济、可持续的工业解决模式。代谢工程和合成生物学的不断发展使得利用微生物已实现了多种生物燃料[7]、天然产物[4, 8-10]、大宗化学品[11]等的工业化生产(图 1)。工业微生物的生产特性是绿色生物制造过程的关键,优秀的工业微生物生产特性包括三大要素:高产、稳定、抗逆(图 1)。高产主要是通过对代谢途径和代谢网络的调控实现目标产物的产量最大化;稳定指菌株的优良性状能够稳定遗传,不易出现生产批次间的波动或菌株退化;抗逆指菌株不易受环境因素影响而导致产量降低。其中,菌株的抗逆属性主要影响生产过程的能耗和成本。工业发酵过程中容易出现产热、酸碱变化等现象,要防止温度、pH等因素变化对菌株生产造成的影响,就需要增加能耗来维持菌株的最佳生长环境,因此会增加生产成本。提高菌株的抗逆性可以避免或降低这一部分能耗,提高生产的经济性。

图 1 微生物细胞工厂生产特性
1.2 生物制造中的胁迫因子

“胁迫因子”是指各种不利于生物生长或生产的环境因素。在微生物作为底盘细胞的工业生产过程中,胁迫因子会抑制微生物的生长代谢及发酵性能,增强微生物对多种胁迫的耐受性是提高生产效率、降低经济成本的关键。工业微生物面临的胁迫压力复杂多样,胁迫因子与细胞结构、理化因素、代谢途径调控有着至关重要的联系(图 2)[12-17]。以生物乙醇工业发酵为例,酿酒酵母可能受到温度、pH值、糖、乙醇、钠离子、亚硫酸盐、乙酸、乳酸和糠醛等胁迫因素的影响,当这些胁迫因素的水平超过一定阈值就会对酿酒酵母的生长造成明显的影响。例如,发酵温度高于最适生长温度会导致细胞内蛋白质变性、活性氧自由基(ROS)水平升高,进一步造成染色体、细胞膜、细胞器等结构的破坏以及代谢水平的降低。胁迫因素几乎存在于所有微生物发酵体系中,并且通常表现为多因素同时存在,产生胁迫效应的叠加。目前工业菌株普遍存在鲁棒性和抗逆性不足的问题,因此,构建在多重胁迫条件下具有抗逆性、环境自适应性和高鲁棒性的微生物菌株,是发酵过程节能降耗的根本途径。

图 2 底盘细胞工厂发酵工艺面临的胁迫因子
1.3 底盘细胞工厂的胁迫应答机制

微生物细胞在胁迫环境下,其自身的信号转导、基因表达、蛋白质和代谢物都会发生一系列的动态变化,细胞工厂主要通过调节内在胁迫应答系统来维持细胞正常生理功能。了解细胞对各种胁迫应答的分子机制,对提高细胞的抗逆特性具有重要帮助(图 3)。微生物主要的胁迫应答机制包括:(1)热激蛋白(HSP),帮助蛋白质在翻译阶段形成正确构象,并且使蛋白质在胁迫环境中维持构象稳定[18];(2)抗氧化系统,由酶促体系和非酶促体系组成[19],清除细胞内ROS;(3)泛素和类泛素蛋白,可以标记错误折叠的蛋白质,使变性的蛋白质被清除,从而提供氨基酸原料用于新生蛋白合成[20];(4)细胞处于长时间的饥饿、高渗、热激等条件时,细胞内海藻糖的含量会发生显著升高,海藻糖代谢在不同胁迫应答中起关键作用[21];(5)细胞可以通过改变膜脂组成来提高细胞对有机溶剂的耐受性[22-23];(6)有机酸进入细胞会造成细胞内部pH降低,过量的质子可经过ATP酶泵出细胞外[24]。上述这些胁迫响应机制受一系列应激相关的转录因子和信号通路的调节[25]

图 3 微生物细胞工厂主要的胁迫应答机制
2 抗逆特性推进发酵工业的发展

为解决复杂、非理想化的工业发酵过程,底盘细胞需要具有抗高温、抗酸碱、抗高渗、抗氧化等抗逆特性。了解细胞对各种胁迫的应激反应的分子机制,对提高细胞抗逆性和推进发酵工业的发展具有非常重要的帮助。

2.1 抗热

在实际工业发酵中,控制发酵温度需要使用大量的冷却水,过高的环境温度会极大地增加冷却水用量,增加发酵成本,因此筛选得到耐高温的底盘菌株能很大程度上降低发酵成本,产生可观的经济效益[7, 26]。一些细胞内源的或外源的抗氧化剂可以起到抗热的作用。例如,酵母向胞外分泌和积累谷胱甘肽可以消除有害的胞外化学物质,是酵母在高温下集体生存的必要充分条件[27]。多重防御系统(MDS)通过整合多种功能和多种来源的抗逆基因以及不同强度的启动子,提高了工业酵母在高温下的生产性能,37 ℃下乙醇产量达到120.3 g/L,发酵效率提高6.9%,冷却能耗比正常工艺降低45.1%,以公司年产35万吨乙醇为基础,工程菌株高温发酵年利润增加约3 200万元[7]。通过微生物热量智能调节引擎(IMHeRE)将大肠杆菌耐热与细胞数量调控智能化,40 ℃高温下发酵生产赖氨酸,产量较对照提高了2~5倍[26]

2.2 抗酸碱

在发酵过程中,微生物消耗营养物质并积累代谢产物,对发酵环境的pH造成扰动,造成酸碱胁迫[28]。酸碱胁迫条件会抑制生产菌株的生长,并干扰细胞代谢,造成氧化应激和ATP消耗,抑制糖酵解过程,损害质膜稳定性,进而诱导程序性细胞死亡[29]。微生物进化出多种耐酸机制对抗生存环境中的不利因素,其中包括谷氨酸脱羧酶(GAD)系统、生物大分子修复机制[30]、生物膜的形成[31]、质子泵[32]等。Zhang等[33]通过适应进化获得了一株盐酸耐受性提高3.5倍、乳酸耐受性提高638倍的干酪乳杆菌。利用微生物自身实时感应并自主调节细胞内外pH是解决酸碱胁迫的新思路,研究者在大肠杆菌中构建了一个pH自调控系统,系统由一个酸诱导启动子Pasr控制的谷氨酰胺酶基因glsA (催化谷氨酰胺生成氨)和一个碱诱导启动子PatpB控制的乳酸脱氢酶基因ldhA (催化生成乳酸)组成,将其应用在番茄红素生产菌株中,显著提高了细胞生长的稳定性和番茄红素产量,同时大幅减少了发酵中的酸碱用量[34]

2.3 抗高渗

工业发酵过程中高底物浓度导致的渗透压胁迫,是目前工业微生物发酵生产面临的主要胁迫之一。发酵前期环境渗透压升高,致使底盘细胞脱水、变形。一些细胞工厂具备耐高渗透压的特性,如运动发酵单胞菌和解脂耶氏酵母等,细胞在高糖浓度下可正常生长和生产[35-36]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)在多重应激条件下快速激活信号转导通路中起着至关重要的作用。Hog1p作为HOG高渗透压信号转导通路中重要的蛋白激酶,通过磷酸化来激活胁迫相关的转录因子Hot1p、Msn2/4p等。Kim等[37]通过表达钙调蛋白CaM来促进Hog1p的磷酸化,从而提高酵母细胞对高渗透压的抵抗能力。通过增强底盘细胞抗渗透压胁迫的能力,可推进工业发酵生产的进一步发展。

2.4 抗氧化

酿酒酵母在有氧代谢的过程中会产生ROS,进而造成细胞膜脂质氧化、核酸损伤以及蛋白质氧化毒性等。在发酵过程中,多种胁迫因素都会加速ROS的大量积累,从而导致氧化胁迫,进而引起细胞结构和功能损伤。本课题组基于对酿酒酵母抗氧化防御体系的分析,挖掘嗜热栖热菌和酿酒酵母内的抗氧化蛋白基因,在表征抗氧化蛋白的性能后,将验证结果较好的基因组合成多功能基因线路,构建人工抗氧化防御系统并将其整合到酿酒酵母基因组。发酵验证表明,工程菌株细胞生长量及乙醇产量均比对照有明显提高,ROS含量测定和线粒体完整性检测结果显示导入人工抗氧化防御系统可以减少ROS对宿主细胞的胁迫[38]

3 抗逆属性的分子调控与改造策略

微生物细胞工厂抗逆属性的获得方式主要有两种:一是依靠理性设计调控元件和抗逆基因组装成抗逆基因线路,二是通过非理性的分子水平的菌株进化来实现。

3.1 基因调控及智能化改造

通过对基因的精准调控可改变细胞工厂的适配性与鲁棒性。提高微生物应对胁迫环境的响应可以更好地发挥细胞抗逆能力,使其减少非胁迫状态下的物质和能量消耗。抗逆微生物智能化的基础来自各种调控元件和系统,如何可控可预测地设计和调节胁迫响应系统,使其在宿主细胞中适配并稳定发挥功能,是一个重要的问题。

基于调节元件的生物传感器可动态调控细胞工厂对环境信号、细胞外化学物质和细胞内代谢物的敏感程度,产生一系列基于环境响应的生物传感器(温度响应[39]、酸碱响应[40-42]、毒性代谢物响应(图 4a)[43]),提高底盘细胞工厂的自主智能抗逆。研究者通过在大肠杆菌中对胁迫响应元件(启动子)动态调控,可精确控制生物过程中的基因表达,实现实时代谢控制[44-46]。在酿酒酵母的合成生物学改造中,通过将筛选并验证的胁迫驱动型启动子用于强化谷胱甘肽合成途径以及乙酸降解途径中的多个关键基因的表达,降低细胞代谢负担的同时,在高温发酵中乙醇产量提高了49.5%[47-48]。IMHeRE的基因线路包括从嗜热微生物中筛选得到的HSP作为耐热功能元件,以及人工设计的RNA温度响应开关作为调控元件,利用对不同温度响应的RNA温度响应开关调控不同温度下效果最佳的HSP,实现了工程菌株的梯级耐热[26]

(a)一种使用代谢酶组装合成转录因子识别响应异戊烯基二磷酸酯(isopentenyl diphosphate, IPP)的生物传感器。当IDI与IPP结合时形成二聚体结构,使上游激活序列与GAL4的激活域距离拉近激活转录。在没有PAR1二聚体的情况下,pGAL10不转录。(b)低温诱导的生物传感器。 图 4 微生物细胞工厂基于调节元件的动态调控

环境胁迫因子也可以作为有利的诱导物来调节细胞代谢,从而替代发酵过程中添加化学诱导剂。研究者通过低温失活的转录抑制因子cI434和高温失活的烟草病毒蛋白酶的定向进化,在大肠杆菌中开发了一种低温诱导的生物传感器(图 4b)[39]。类似地,对来自酿酒酵母的转录调控蛋白Gal4进行进化得到温度敏感型突变体Gal4m9,其可在30 ℃时失去诱导GAL启动子的功能,而在24 ℃时恢复诱导功能[49]。使用这种温度响应调节系统,实现了细胞生长与产量的解偶,从而显著提高了类胡萝卜素的产量[50]

3.2 基于分子手段耐受底盘菌株的快速进化

微生物底盘菌株的快速进化是细胞在选择压力的胁迫下,秉承“物竞天择,适者生存”的原则,获得具有优良表型的突变体。以特定的底盘细胞为出发菌株,动态调控基因组的遗传物质,从分子水平上进行突变或者重组,获得大量的突变体文库,筛选目标高产菌株。

3.2.1 与生物传感器偶联的适应性实验室进化(ALE)

ALE以特定或逐渐增加的压力来筛选获得特定条件下鲁棒性较好的突变体[51]。为了适应当前高通量,甚至超高通量的研究趋势,研究者将生物传感器与实验室适应性结合起来,通过流式细胞仪分选高产菌株,使微生物细胞工厂的定向进化成为可能(图 5a)。例如,以3-羟基丙酸(3-HP)生物传感器为主结合高通量的筛选方法,获得了抗生素浓度不断增加后性能稳定的高产菌株(图 5a)[52]

(a)适应性实验室进化与生物传感器结合筛选高性能突变体;(b)全局转录调控因子σ的功能示意图及全局转录调控工程;(c)基于CRISPR系统的同源重组编辑策略;(d) SCRaMbLE重排原理。 图 5 微生物细胞工厂基于快速进化的动态调控及改造策略
3.2.2 全局转录因子工程(gTME)

gTME是一种能在整体水平上改变细胞基因组转录而获得目的细胞表型的定向进化方法,能在全局水平上强化微生物细胞的目标性能,是在基因和细胞水平上改造微生物细胞的新途径。gTME中研究较多的是σ因子,σ因子是DNA依赖型RNA聚合酶的活性中心,与RNA聚合酶核心酶构成全酶,参与胞内所有RNA的合成,其功能如图 5b [53-54]所示。gTME可用在特殊调控作用的转录因子,如突变酿酒酵母的弱酸转录激活因子Haa1可得到耐受乙酸的菌株[55]。使用gTME和饱和诱变技术,筛选得到了高产乙醇的酿酒酵母菌株[56]

3.2.3 基因体内连续进化(ICE)

ICE是利用酵母自身的反转座子基因Ty1转录为mRNA后反转录为cDNA后再整合到Ty1,反转录过程中容易出现错误,造成突变。将需突变的基因或表达盒放在Ty1中,用半乳糖诱导表达Ty1,可筛选得到突变株。2018年,MIT的Shoulders实验室首次报道了MutaT7系统(将T7 RNA聚合酶与脱氨酶融合表达)可以实现特定基因的体内连续进化[57]

3.2.4 基于CRISPR的基因组全局编辑与进化

基于CRISPR系统的多位点编辑(CHAnGE、MAGESTIC、Target-AID和等基因组规模的进化策略全局动态调控底盘细胞进化系统yEvolvR)可从分子层面进行定向调控(图 5c)。CHAnGE通过gRNA介导的同源修复促进了基因组编辑的精确性和有效性,提高了酿酒酵母对糠醛和乙酸的耐受性[58]。MAGESTIC (multiplexed accurate genome editing with short, trackable, integrated cellular barcodes)在CRISPR/ Cas9系统的基础上利用可基因组整合的条形码策略,快速高效地实现多位点的精准编辑。Targeted-AID将胞嘧啶脱氨酶与CRISPR/ Cas9系统融合,实现基因组DNA上胞嘧啶的靶向编辑。yEvolvR由nCas9-gRNA引导在目标基因座上形成缺口,Pol I-5M以低保真度合成新链并切割置换的链[59]

3.2.5 基于合成型染色体的快速进化(SCRaMbLE)

人工合成酿酒酵母基因组(Sc2.0)通过系统性地在基因3′UTR处插入loxPsym序列重排元件,诱导产生DNA片段的删除、倒位、增加、易位等基因组结构变异[60-65](图 5d)。合成型酵母基因组重排技术可实现菌株性状的快速进化,为研究基因组结构变异与表型变化之间的关系提供了一种快速、全新的方法。

SCRaMbLE重排处理后,筛选得到耐碱性(pH = 8.0)的菌株[66]。通过将合成型染色体酵母与其他单倍体酵母杂交形成杂合二倍体,SCRaMbLE可更快速和高效地筛选得到耐高温和耐咖啡因的菌株[67]。另外,研究者开发了反向双筛选标记的SCRaMbLE系统(ReSCuES),这种方法大大降低了假阳性菌株的发生,通过此方法可筛选得到一系列耐受乙醇、高温以及乙酸的菌株[68]

4 细胞工厂的多重抗逆特性与“双碳计划”

2020年9月22日,国家主席习近平在第75届联合国大会上提出了碳减排的两阶段目标(简称“双碳”战略目标),即中国CO2排放于2030年实现碳达峰,2060年实现碳中和。碳排放问题的根源是化石能源大量开发和使用,治本之策是改变能源发展方式,加快推进绿色制造,减少工业生产过程中CO2的排放量,通过采用去碳和固碳技术实现碳中和。将多重抗逆细胞工厂与绿色经济低碳制造为主的“双碳计划”结合,直接构建以可再生资源为底物的多重抗逆细胞工厂,减少生产工艺的能源浪费,提高固定CO2的效率,加快CO2的循环使用,达到彻底摆脱化石能源依赖的最终目标。

细胞工厂主要以淀粉、木质纤维素,甚至是CO2等可再生资源为底物生产目标化合物或生物燃料,相较传统依赖石油等不可再生能源的生产工艺,可实现CO2的循环再生[69]。构建可再生资源生产工艺的低碳、零碳、负碳的新型工业体系,从能源供应系统到能源消费成本形成了一种绿色、高效和可持续的发展模式。微生物细胞工厂作为新型工业体系的一种,在实际工业生产过程中存在多种胁迫因子,间接或直接影响底盘细胞生长和产物合成效率。为提高产物合成效率,常对细胞工厂进行发酵工艺优化,但传统的工艺优化耗能过多,不利于低碳、低成本的绿色发展模式。

多重抗逆特性的细胞工厂,一方面以可再生原材料为底物,快速生产具有较高价值的化学品及生物燃料;另一方面,通过抵抗多重胁迫因子的菌株特性降低发酵工艺优化的成本与能耗问题。从可再生能源的利用效率、化石能源的使用比重、生产工艺成本、耗能等方面综合考虑,多重抗逆特性微生物细胞工厂的设计与构建可推动传统化工产业向绿色、经济、可持续的发展模式靠近。

5 结论与展望

提升微生物细胞工厂的抗逆性可以释放出底盘细胞在工业应用中的巨大潜能。通过合成生物学的分子调控手段改造底盘菌株,改善目标表型,提高细胞工厂的抗逆属性与生产特性,推动了拥有抗逆特性的底盘细胞用于工业生产发展的进程,为解决资源紧缺、环境污染等重大难题提供了强大的理论基础与技术支撑。

智能抗逆菌株将是未来抗逆菌株改造的重要方向:(1)开发响应各种胁迫因子的生物传感器,调控生物传感器的稳定性、严谨性、灵敏度、检测范围等指标,对生物传感器响应信号的拓展以及性能的优化将是实现智能生物制造过程的重要基础;(2)在响应胁迫因子的生物传感器的基础上,开发细胞完全自主的动态调控策略,实现对抗逆性的自主调节,降低发酵过程的生产成本,提高底物利用效率和发酵产量;(3)依靠合成生物学技术,开发设计多种新型建库方法,结合高通量及单细胞筛选,实现菌株的智能定向进化是目前生物制造所要解决的关键问题。

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