生命科学   2018, Vol. 30 Issue (9): 1003-1009.  DOI: 10.13376/j.cbls/2018120.
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专刊:基因编辑技术2.0

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朱娉慧, 罗群, 王曜峰, 冯波. 同源重组及非同源末端连接修复途径介导的基因编辑:CRISPR技术的认知、应用及展望. 生命科学, 2018, 30(9): 1003-1009. DOI: 10.13376/j.cbls/2018120.
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ZHU Ping-Hui, LUO Qun, WANG Yao-Feng, FENG Bo. CRISPR-induced genomic editing via homology-dependent and independent repair pathways: recent insights, applications and perspectives. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2018, 30(9): 1003-1009. DOI: 10.13376/j.cbls/2018120.
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基金项目

国家自然科学基金面上项目(31771635);国家重点基础研究发展计划(“973”计划)(2015CB96702)

作者简介

冯波,博士,香港中文大学生物医学学院副教授。2006年毕业于新加坡国立大学淡马锡生命科学院,获得博士学位;随后,在新加坡科技局属下的基因组研究院任职博士后/副研究员。在此期间,冯博士从事了大量有关诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS cells)的研究,建立了由小鼠和人类成纤维细胞转化形成iPS cell的技术平台,并首次发现和证实了一些新基因在重编程(reprogramming)过程中的重要作用,有关文章发表在国际著名科学期刊NatureNat Cell Biol以及Cell Stem Cell
目前,冯博士所带领课题组主要从事有关干细胞分子调控及基因组编辑技术的研究,探索干细胞及分子技术的转化及应用。最近,以最具突破性的CRISPR/Cas9技术为基础,冯博士所带团队开展了在人类细胞中进行同源介导及非同源介导的基因敲入的研究工作,成功建立了在人类细胞中高效敲入目的基因的新方法,填补了基础理论及技术方法上的空白,有关成果于2016年发表在Nucleic Acids Res上 。

通信作者

冯波, E-mail: fengbo@cuhk.edu.hk

文章历史

收稿日期:2018-06-21
同源重组及非同源末端连接修复途径介导的基因编辑:CRISPR技术的认知、应用及展望
朱娉慧 1#, 罗群 1#, 王曜峰 1,2, 冯波 1,2     
(1 中国科学院广州生物医药与健康研究院,华南干细胞与再生医学研究所,广州 510530)
(2 香港中文大学生物医学学院,中国香港)
摘要:CRISPR系统具有精确识别及剪切特异性DNA序列功能而被开发成一种高效的基因编辑工具。它以成本低廉、操作简便、效率高及通用性广等优势,成为新一代最具代表性的基因编辑技术。在应用中,CRISPR系统可在特定靶点形成DNA双链断裂,继而诱导同源重组(HDR)或非同源末端连接修复(NHEJ),为基因组定向改造与调控带来了革命性的突破。该文将对近年来生物科学领域中发展迅猛的研究工具CRISPR/Cas系统进行介绍,包括其结构、作用原理、类型及应用等,并重点阐述同源重组或非同源末端连接修复途径介导的基因定向编辑技术及应用。
关键词CRISPR    同源重组    非同源末端连接    基因编辑    
CRISPR-induced genomic editing via homology-dependent and independent repair pathways: recent insights, applications and perspectives
ZHU Ping-Hui 1#, LUO Qun 1#, WANG Yao-Feng 1,2, FENG Bo 1,2     
(1 South China Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Guangzhou Institute of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510530, China)
(2 School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong SAR, China)
Abstract: CRISPR is a high effective and robust system to target a specific genomic region with high accuracy. It has become the most popular genomic editing tool in biomedical and clinical research nowadays. CRISPR complex can induce double-strand breaks at a specific genomic region. Mediated by homology-dependent or independent repair pathways, precious genomic editing can occur at the broken sites, using various donor designs. Here we review the composition, principle, as well as various types of CRISPR systems discovered and applied in current biomedical studies. In addition, a summary of knock-in strategies mediated by homology-dependent or independent repair pathways will be presented. Recent improvements and applications of these technologies will also be discussed. Furthermore, we highlight the current challenges in CRISPR-induced genomic editing in biomedical and clinical research.
Key words: CRISPR    homology-directed repair    non-homologous end joining    genomic editing    

基因组定点编辑指对受体细胞基因组的特定位点进行精准地切割、插入或突变,从而实现对基因组的特异改造,该方法是深入了解疾病发病机制、探索基因功能乃至医学治疗的重要手段之一。

早期研究者主要利用基因同源重组的方法及体细胞核移植技术对基因进行改造[1-2],但由于在自然情况下,基因重组的过程非常罕见且效率非常低,而且细胞核移植技术耗时耗力,成本昂贵,严重制约了基础研究和临床应用[3]。科学家们不断寻求更加精准、便捷的方法对特定的基因组位点进行高效敲入或者靶向修饰。人工核酸酶介导的基因组编辑技术是研究者开发出来的具有序列特异性的DNA核酸酶,能够对基因组进行高效定点编辑。其中主要有两种类型的酶,锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)[4-5]和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)[5-6],由于改造难度和成本都降低,已在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜能,并很快得到了广泛应用[7-15]。然而,ZFN和TALEN技术对每一个基因位点的编辑都需要经过重新设计、合成并组装具有特异性DNA识别能力蛋白模块的繁琐步骤,载体构建复杂,周期长,难于用来开展大规模基因编辑的筛选,绝大多数实验室都难以自行完成完整的操作,对其推广造成了障碍,从而限制了其应用前景。

2012—2013年,科学家发现了基因编辑的另一个突破性技术CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated system)[16-24],使基因编辑技术进一步简化。该技术利用RNA介导的核酸酶与靶DNA序列结合,从而达到基因组定点编辑的目的。与以DNA结合蛋白为基础的基因编辑技术ZFNs和TALEN相比,以RNA介导的CRISPR/Cas技术具有良好的靶向性、构建简单、可同时操作多个基因等优点,其原理也更加简单,只需要遵循RNA与DNA之间的碱基互补配对原则。该技术一经问世,迅速成为生物医学领域的前沿热点,并引发新一轮的基因治疗研究热潮。

本文将对近年来生物科学领域中发展迅猛的研究工具CRISPR系统进行介绍,包括其结构、作用原理、类型及应用等,并重点阐述同源重组(HDR)或非同源重组基因组(NHEJ)修复途径介导的基因定向编辑。

1 CRISPR系统的结构及作用机制

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一个具有成簇规律间隔的短回文DNA重复序列的家族,存在于约40%已测序细菌和90%已测序古生菌中[25]。CRISPR序列中的重复序列高度保守[26],含有可以形成发夹结构的回文序列,而间隔区是被细菌俘获的外源DNA序列,可以对靶基因进行识别[27-28]。在CRISPR序列上游有一个多态性的家族基因,被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated, Cas)。Cas基因编码一种双链DNA核酸酶,在guide RNA的引导下,该酶能够对靶基因位点进行切割[29]。Cas基因与CRISPR序列在共同进化中,逐渐形成了在细菌中具有高度保守性的CRISPR/Cas系统。目前已相继发现多种类型的Cas基因,如Cas1~Cas10、Cas12a和Cas 13a。

2 CRISPR系统在当前的生物医学研究中广泛应用

根据参与CRISPR/Cas系统的Cas蛋白不同,CRISPR系统可分为Class 1和Class 2两种类型[30]。Class 1 CRISPR/Cas系统需要众多蛋白的参与,且免疫机制相当复杂,不适用于基因组工程;而Class 2系统需要的核糖核蛋白复合物相对简单,是目前研究最多、应用最广的CRISPR/Cas系统。

2.1 CRISPR/Cas9系统

CRISPR/Cas9系统属于Class 2中的Type Ⅱ类型,包含一个单一的多功能Cas9和两个非编码RNA,即crRNA和反式激活crRNA (tracrRNA)[31]。人工合成的sgRNA (short guide RNA)具有3个结构域:约20 nt与DNA特异性结合的互补区;约42 nt模拟crRNA-tracrRNA复合物的发夹结构域,能与Cas9结合;约40 nt的转录终止子。将表达Cas9蛋白和sgRNA的质粒共同转入细胞后,Cas9蛋白与sgRNA结合形成核糖核蛋白复合体,识别靶序列并与其结合[16, 32],进行切割形成DNA双链断裂[33],其中,sgRNA与靶序列之间的特异性互补以及靶DNA 3′端PAM序列的存在是靶位点识别和DNA链断裂的前提条件。根据Cas9的来源不同,PAM序列也有所不同,例如化脓链球菌PAM序列为5′-NGG-3′,嗜热链球菌PAM序列为5′-NGGNG-3′[34]

此外,Cas9不但可以应用于编辑基因,还可以用于调控基因的表达。当Cas9的两个剪切活性结构域HNH和RuvC全部突变时,将不具有核酸酶活性,成为dCas9 (dead Cas9)。dCas9虽然没有剪切DNA的能力,但仍然可以在gRNA的引导下与特定的DNA序列结合[35]。Maeder等[36]研究发现,dCas9与转录抑制因子(KRAB, SID)或转录激活因子(VP64, p65)融合后将会特异地抑制或促进靶基因的表达。这种方法与传统的Cas9系统相比具有巨大的优势,该系统能在不改变基因组的条件下,通过一些效应因子调控某些基因表达从而达到表观遗传学修饰的目的[37];且其不受基因大小的限制,可以同时上调多个基因的表达。CRISPR-dCas9系统为后续的疾病研究工作提供了更加便捷的工具。

2.2 CRISPR/Cas12a系统和Cas13a系统

除Cas9系统外,CRISPR家族中的两个成员Cas12a和Cas13a也迅速获得了业界的广泛关注。CRISPR/Cas12a系统也称作CRISPR/Cpf1系统,是一类新型的CRISPR/Cas系统[38-39]。由于Cpf1蛋白切割而成的DSB缺口会形成约8 nt的长黏性末端,因此,它有效降低了CRISPR/Cas9系统经常会发生的脱靶效应问题,进一步扩大了编辑靶序列的选择范围。同时,黏性末端的产生也为下游的基因编辑工作带来了极大的灵活性。此外,该系统更简化,只需要1个Cpf1蛋白和1个RNA,而且Cpf1蛋白相对分子质量小于Cas9蛋白,其更容易进入细胞,从而提高了编辑的成功率。

2016年,Abudayyeh等[40]发现的CRISPR/Cas13a系统可以有效靶向RNA进行定点切割,因此是一种高效的RNA编辑工具,而且在Cas13a系统切割靶RNA之后仍能保持活性,其可能还表现出没有区别的切割活性,可以在一种被称作“附带切割(collateral cleavage)”的过程当中继续切割其他的非靶RNA。张锋团队基于Cas13a系统开发出的SHERLOCK (specific high sensitivity enzymatic reporter UnLOCKing)系统,可用于检测低浓度的寨卡病毒及病毒载量,还可以对人类DNA进行基因分型,并鉴定游离DNA中的肿瘤突变[41]。未来,Cas13a有望继续扩大CRISPR的应用范围,为人类医学研究做出更大贡献。

3 CRISPR/Cas介导的基因定点敲入

在真核细胞中,当基因组上出现双链断裂缺口(DNA double strand breaks, DSBs)时,会启动常规的修复途径,包括同源重组(homology directed repair, HDR)或非同源重组(non-homologous end joining, NHEJ)[42],这是细胞的一种自身保护机制。HDR仅发生在DNA经历或完成复制的S期和G2期,而NHEJ可在整个细胞周期发生[43-46]。CRISPR/Cas系统是强有力的“DNA剪刀”,能高效地切割DNA链,DSBs形成后,CRISPR/Cas系统主要联合HDR或NHEJ两条修复途径来完成基因编辑。

CRISPR/Cas系统可以实现由HDR介导的精确的基因点突变、外源基因敲入或者条件敲除等,如通过与sgRNA和Cas9一起注射单链或双链的同源模板替换相应基因可以达到基因的定向修饰。另外,CRISPR/Cas系统联合HDR或NHEJ途径已被广泛用于获得转基因动物、细胞系以及动物全基因组的基因敲除等。有研究发现,CRISPR/Cas联合NHEJ介导的DNA随机整合频率比CRISPR/Cas联合HDR引起的DNA插入片段高出1 000倍以上[47]。为了克服HDR低效的基因敲入策略,近年来已经开发了一系列可编程的基于核酸酶的基因组编辑技术,使得人们能够在各种真核生物,特别是哺乳动物中进行有针对性的、高效的基因修饰。

3.1 HDR途径介导的基因敲入

HDR具有高保真性,一般不会引起突变,在正常修复的过程中,需要把未受损的姐妹染色单体的同源序列作为模板来实施修复,从而也就限制了其修复过程发生在细胞周期的S期和G2期。HDR发生机制是两个同源DNA分子发生联会[48],引入断裂DNA,然后在两条重组DNA之间形成碱基互补配对的片段起始区[49],链入侵后,两个DNA分子相互交叉的DNA链就联系在一起,形成holliday junction的交叉结构[50],最后剪切holliday junction连接体,完成HDR修复。

基因工程中,通过人工合成同源单链DNA或双链DNA模板就可以在真核生物和细胞系中实现基因定向编辑,如基因的定向敲除、构建不同的表型、敲入外源基因或报告基因,甚至还可以部分删除或倒位染色体等。把表达sgRNA、Cas9蛋白的质粒以及人工合成的同源模板即DNA“修复模板”序列一同转入研究者感兴趣的细胞中就可以实现CRISPR/Cas联合HDR介导的精确的基因定向编辑[51]。然而,HDR介导基因敲入的效率往往很低,所以,如何进一步提高HDR的效率成了近期CRISPR技术的研究热点之一。Maruyama等[52]发现,在NHEJ缺陷的细胞株中HDR的效率会升高。在NHEJ过程中,DNA连接酶IV(DNA ligase IV)参与DNA修复,他们通过使用这种酶的小分子抑制剂Scr7来抑制NHEJ途径,从而提高HDR效率。向CRISPR系统中添加Scr7,细胞中HDR的效率可提高19倍,而在小鼠模型中HDR的效率也提高了两倍以上(从28.6%到58.3%)[52]。Chu等[53]也发现,在引入CRISPR系统时注射短发卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)、小分子抑制剂Scr7或者4型腺病毒的E1B55K和E4orf6蛋白,通过抑制参与NHEJ过程的KU70、KU80和DNA连接酶IV,能够将细胞系中的HDR效率提高8倍。可是,在一些人细胞中,尤其是在人胚胎干细胞(hESCs)及诱导干细胞(iPSCs)中,HDR的效率依然很低,即使使用CRISPR/Cas系统,HDR效率也没有得到提高。有研究显示CRISPR/Cas系统联合HDR介导的基因敲入效率仅有10-5[54],但是,CRISPR/Cas系统联合NHEJ却能弥补这一缺憾。

3.2 NHEJ途径介导的基因敲入

NHEJ在不依赖DNA同源性的情况下将两个DNA的断裂端彼此连接在一起,从而快速地修复DSB,是最活跃的修复机制,而且效率高。NHEJ修复途径主要是当发生DSBs时,异二聚体Ku70/Ku80分别结合到两个断裂的DNA末端,在断裂处形成一个“桥”状的Ku环结构[55-56],然后招募DNA-PKcs分子与DNA结合,使复合体重塑,对末端进行加工并填补缺口,最后DNA连接酶IV/XRcc4进行连接,完成NHEJ修复。

CRISPR/Cas系统联合NHEJ具有很高的效率,在多种类型的人细胞,包括人胚胎干细胞中,使用CRISPR/Cas9系统联合NHEJ介导的基因敲入效率明显高于联合HDR[57]。进一步研究发现,由CRISPR/ Cas9介导的DSB有另外两种可能的修复机制,c-NHEJ (canonical non-homologous end joining)途径[57]和a-NHEJ (alternative non-homologous end joining)途径[58]。其中,c-NHEJ途径在细胞中发生的频率更高,因此,使用c-NHEJ途径有利于实现高效的基因敲入。Auer等[59]发现,利用NHEJ能够高效地将大于5.7 kb的片段插入到斑马鱼基因组中。该方法极大地扩展了斑马鱼的基因组编辑库,并且还可以用于其他物种的基因编辑。在研究中引入外源DNA序列来标记内源基因具有一定的挑战,Lackner等[60]同样利用NHEJ途径,在将质粒元件整合进目标基因组的条件下,在N或C末端高效地标记了内源基因。2016年,本课题组首次在人类细胞中利用NHEJ策略建立了长基因片段的高效敲入筛选平台[57],并利用此平台成功在人类胚胎干细胞中将长基因片段的非药物处理方法的敲入效率提升到1%以上。2017年,Belmota课题组在体内水平利用AAV病毒建立了非同源重组原理基因敲入方法(homology-independent targeted integration, HITI)[61]。Belmota和同事利用此方法在大鼠体内对视网膜退化的致病基因进行了高效的基因矫正治疗。这些成功的案例都揭示了非同源重组途径在生物医学领域的应用前景。

由于HDR效率远低于NHEJ,使用HDR抑制剂去增强NHEJ的效率似乎不可取。此外,NHEJ介导的DSBs修复易于发生插入或缺失后的移码错误[62],导致基因的ORF阅读框中断,提前终止。这些特性使得目前利用NHEJ途径进行基因编辑的临床研究依然面临技术挑战。

4 HDR和NHEJ修复途径介导的基因编辑方法在生物医学研究中的应用

基因工程涉及对基因组的靶向修饰,这种高效便捷的修饰对于基础科学、生物技术及医学的变革有着巨大的可能。CRISPR/Cas系统联合HDR或NHEJ介导的基因编辑已被广泛应用于基因工程中,如控制转录、改变表观基因组、全基因组筛选、染色体成像、缓解动物的遗传疾病及癌症的治疗等。

CRISPR/Cas基因编辑已被证明可用于几乎所有类型的哺乳动物细胞,包括诱导多能干细胞和癌症特异性免疫细胞,如CRISPR/Cas9联合NHEJ能够有效地对人类胚胎干细胞以及体细胞进行基因编辑[57]。Song等[63]报道了通过CRISPR-Cas9技术治疗β-地中海贫血(β-thalassemia, β-Thal),首先将患者来源的皮肤细胞诱导分化为诱导性多功能干细胞(β-Thal-iPSCs),再用CRISPR-Cas9技术修复血红蛋白β-球蛋白(hemoglobin β, HBB)基因。结果显示,基因修正后的细胞核型正常,在向造血细胞分化的过程中,可以高比例地生成各类造血祖细胞,并表达正常的β-球蛋白。而在另一项研究中,Huang等[64]用CRISPR-Cas9系统对镰状细胞性贫血(sickle-cell anemia)患者的iPSCs细胞进行基因编辑,基因修正后的iPSCs可以成功地分化至网织红细胞阶段,并表达正常的β-球蛋白。Ousterout研究团队通过CRISPR-Cas9技术成功地纠正了DMD患者成肌细胞(myoblast)中的DMD基因突变,基因编辑后的成肌细胞可以在体外及体内条件下表达正常的抗肌萎缩蛋白[65-66]。Feng等[67]利用CRISPR-Cas9系统对骨肉瘤细胞系KHOS和U-2OS中的CDK11基因进行了有效地沉默,结果发现,CDK11基因沉默的骨肉瘤细胞生存和增殖能力都显著减弱,迁移性和侵袭性也显著降低。类似地,Kawamura等[68]通过CRISPR-Cas9技术突变了前列腺癌细胞系DU145中的NANOG和NANOG8基因,结果发现,突变后的细胞系成瘤性大大降低,表明NANOG/NANOG8基因在前列腺癌发生中具有重要作用。上述两项研究也为骨肉瘤及前列腺癌治疗提供了新的分子靶标。在癌症免疫治疗领域,研究人员通过利用CRISPR/Cas9系统定向插入CAR基因并递送到特异性位置的编辑技术构建了更有效的CAR-T细胞,而且增强了小鼠的肿瘤抑制作用[69],这是一种更强有力的免疫疗法,有助于未来癌症免疫疗法的发展。

另一方面,基因编辑在建立新疾病动物模型方面展示出了很大的潜能。不需要使用传统的胚胎干细胞操作的方式,在受精卵中进行显微注射或简单电穿孔可以有效实现CRISPR/Cas介导的基因编辑(包括NHEJ和HDR介导的各种技术),这种在受精卵中进行基因编辑的方式省去了分离、培养和编辑胚胎干细胞的步骤,节省了时间,且加速了在现有动物模型中产生额外突变的进程。如Platt等[70]采用CRISPR/Cas9系统分别构建了Kras、p53、Lkb1基因突变的小鼠模型,模型鼠发展出了肉眼可见的肺腺癌病理表征;Suzuki等[61]通过在体内进行CRISPR/Cas9系统介导的非同源靶向整合大片段基因的方法建立了色素性视网膜炎的动物鼠模型,为基础研究和靶向治疗提供了新的途径。

5 结语和展望

CRISPR/Cas汇集了简便、高效、经济和定位精确等多重优点,引领了基因编辑技术的重大革新,在生物医学领域得到了广泛的应用。它不再受模式生物的限制,可以对更加多的物种进行高效的遗传操作,而且已经建立的gRNA文库可以对基因组实行高通量的功能性筛选。

CRISPR/Cas9系统主要联合HDR介导基因的编辑,但HDR的效率比NHEJ要低很多,因此,在很大程度上影响了CRISPR/Cas9系统的编辑效果,对其广泛应用造成了阻碍。虽然CRISPR/Cas9系统联合NHEJ在体内或体外介导基因敲入的效率高于HDR,但是,NHEJ的错配率太高。David Liu的研究团队开发出了一种单碱基的基因编辑技术,通过再次将Cas9基因改造成ecTadA-dCas9,在不切割DNA的情况下,能够把A-T碱基对转换为G-C碱基对[71]。该技术的效率比其他基因组编辑技术要高,而且不会产生副作用,如随机插入和删除等。

在未来的发展中,需要进一步提高同源重组修复的几率或者开发不依赖DNA断裂就可以实现高效的定向基因修饰,进而推广CRISPR/Cas系统在生物医学等领域的应用,发挥其在遗传疾病治疗、疾病相关基因的筛查与检测等方面的巨大潜能。

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