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CN:31-1600/Q
ISSN:1004-0374
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《生命科学》 2004, (3): 182-
探究生命活动的电化学技术
李根喜*,朱德煦
南京大学生物化学系,医药生物技术国家重点实验室,南京 210093
      电化学方法在生命科学研究中的应用越来越广泛。这是因为,生命活动包含了各种各样的电子传递及氧化还原过程,而电化学则是研究电子运动及相关氧还反应的较好方法。同时,生命现象本质问题的解决需要借助更多的研究方法和实验技术来实现。但是,同其他研究手段一样,随着生命科学的飞速发展及相关研究问题的深入,电化学技术也存在一定的局限性。为此,国内外电化学工作者设计了各种电化学装置,发展了一些电化学理论及技术,其中,一种被称为“蛋白膜伏安法”的技术发展极为迅速,并且已应用到生命科学研究的许多方面。
       蛋白膜伏安法,就是使用伏安法研究固定在电极表面的一层或多层蛋白质分子形成的膜。蛋白质在生物体内广泛存在于荷电界面上,如生物膜就是一种荷电界面,电极作为一种研究荷电界面的模型系统有助于我们深入了解蛋白质在生物膜中发生电子传递的分子机制。因此,蛋白膜伏安法对于研究蛋白质(酶)电子传递的机制,揭示相关的生物学过程具有独特的优势。它有许多优点,如可避免蛋白质扩散带来的影响;蛋白样品用量很少,而且由于酶的特异性,对于溶液中的微量试剂也能有很高的灵敏度;可以在一个比较宽的范围内对蛋白质的电活性中心快速精确地施加电压控制;电流与催化速率之间有直接的定量关系;整个实验过程是“交互式”的,即反应可以同时被驱动和检测。在理想条件下,我们可以很方便地观察发生在蛋白质(酶)氧化还原中心的电子传递过程(在无底物状态下) ;在引入底物后,我们又可以从催化峰中得出酶催化的动力学过程。
      蛋白膜伏安法应用到蛋白质(酶)化学领域已经导致了很多有趣而重要的发现。例如,一种线粒体电子传递酶——琥珀酸脱氢酶,在传递电子的时候具有一种二极管效应,即只允许电子向一个方向流动。它在催化延胡索酸还原的时候,只允许外加电压处于一个很窄的电位范围内,如果超出这个范围,酶活性就会被“关闭”。而另外一个与其功能相近的酶——延胡索酸还原酶,则没有表现出这样一种二极管效应。同时,氢/氘的同位素置换对于琥珀酸脱氢酶的双向催化有明显的影响。
      蛋白膜伏安法研究表明,脂双层膜不仅起到提供蛋白质所处基质的作用,它可能有着更为深刻的生物学意义。例如,细胞色素C包埋于合成的脂双层膜中并与之形成超分子化合物后,获得了脱甲基酶的活性。这种使蛋白质获得新的酶活性的方法已被认为是一种基于超分子集合系统的蛋白质工程。脂膜的这种作用的机制目前还不清楚。有证据表明,蛋白质在脂膜内仍保持着接近天然的状态,蛋白质的功能调节与功能转换可能与脂膜提供的特定微环境有关。
      蛋白膜伏安法的应用也发现了其他蛋白质的功能转换。细胞色素P450在微生物降解过程中有重要的作用。肌红蛋白虽然在结构上与细胞色素P450有一定的相似之处,但它不具有脱卤化能力。然而,当把肌红蛋白包埋于DDAB膜内并加以电化学驱动后,研究者发现它模拟细胞色素P450脱卤化的过程,具有了降解有机卤化物的酶活性。研究者还发现处于膜相的肌红蛋白可以通过形成ferryl Mb来氧化苯乙烯。血红蛋白在膜内也可发生功能转换。血红蛋白的生理功能是作为氧的载体,它并不是一种电子传递蛋白。但是,包埋于SP葡聚糖凝胶膜内的血红蛋白,其电子传递能力有了明显的提高,同时,血红蛋白在膜内又表现出过氧化物酶的活性,表观米氏常数(KM)为1.9 mmol/L,因此,血红蛋白在SP葡聚糖凝胶膜内过氧化物酶的活性是很高的。此外,应用蒙脱土包埋的血红蛋白不仅也可以发生直接电子传递反应,而且它对三氯醋酸具有脱卤化作用。
      研究处于膜相的蛋白质,蛋白膜伏安法是很有效的方法。一些血红素蛋白质,如肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素P450在各种类型生物膜中性质的研究已经开展,实验观察到这些蛋白质在膜相的电子传递能力有明显提高,可以与电极表面发生直接电子传递反应。具体机理还不很明确,但一些光谱证据表明,血红素在膜相会形成特定的分子定向,这可能是蛋白质电子传递速率提高的原因。另外,原子力显微镜提供了肌红蛋白分别在裸的热解石墨表面和在DDAB膜内的形貌,结果显示:肌红蛋白在石墨表面聚集成一种链状结构,而在膜内则处于液晶相。这种不同的物理存在状态也可能是一个重要因素。
      蛋白膜伏安法也可应用于研究生物分子的相互作用。一氧化氮与血红蛋白的相互作用因其重要的生理功能而引起了众多研究者的兴趣,这方面已经有很多光谱和动力学研究,但这一相互作用的机制尚未弄清。蛋白膜伏安法为进一步研究这一相互作用提供了新的手段,结果表明,高铁血红蛋白在膜内首先被还原,一氧化氮从溶液中扩散进入膜内并与亚铁血红蛋白的血红素相结合,形成血红蛋白/一氧化氮复合物。然后,一氧化氮在血红素的帮助下还原。最后,血红蛋白/一氧化氮复合物解离,而未配位的亚铁血红蛋白在膜内重新氧化。人体内大部分一氧化氮是通过与血红蛋白的作用而消耗的,这对于了解血管收缩的生理过程非常重要。研究还证实了一氧化氮可以使亚铁血红蛋白在结合氧的状态下氧化等有趣现象。此外,基于蛋白膜伏安法,作者还探讨了有机溶剂如甘油、效应物如ATP对血红蛋白的作用,发现甘油对血红蛋白天然构象和电子传递能力分别起到保护和抑止的作用,而ATP 在低浓度时可稳定还原态的血红蛋白,但使高价态的蛋白质不稳定。
      蛋白膜伏安法研究又表明,有机溶剂与蛋白质的电子传递能力有直接关系。血红蛋白溶于二甲亚砜溶液再修饰到热解石墨电极表面后,其异相电子传递速率有明显提高。在此基础上,对血红蛋白氧化还原过程的热力学进行了研究,并对磷酸根离子和咪唑对其热力学过程的影响作了探讨。研究发现,磷酸根离子与血红蛋白特定位点的结合使血红蛋白的还原熵明显减小,而咪唑的存在可以部分抵消磷酸根离子的作用,这一现象类似于酶的“底物保护”效应。
      蛋白膜伏安法在第三代生物传感器及生物大分子的电化学检测等方面的应用也已见报道。将血红蛋白吸附在铂电极表面对蛋白质进行定量分析,与分光光度法、色谱法相比,蛋白膜伏安法更加简便可行。借助先进的电化学软件,它可以自动分析处理循环伏安图谱,得到实验结果,方法简便、灵敏、快捷,对实验设备要求较低,是一种很有发展前景的血红蛋白痕量测定法。同时,作者在使用蒙脱土、葡聚糖凝胶、DNA、SDS包埋血红素类蛋白质以研究膜相内蛋白质电化学行为的基础上,尝试了大量的无机、有机或高分子材料,发现硅藻土、卵磷脂、聚乙烯亚胺、十六烷基二甲基溴化胺、聚乙烯乙二醇以及一些纳米材料,如纳米金胶、银胶等均可以提高血红素类蛋白质的电子传递能力,改善其酶活性,在此基础上,研制了一系列第三代NO、H2O2、葡萄糖传感器,为信号分子的实时检测以及信号转导的电化学研究打下基础。
      总之,蛋白膜伏安技术为揭示蛋白质(酶)的结构-功能关系提供了一条有效途径,它也是进行蛋白质电子传递过程的热力学和动力学研究的强有力手段。目前,蛋白膜伏安法正处于发展中,我们可以预期它将在生命科学研究中发挥越来越大的作用。
 
 
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