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ISSN:1004-0374
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《生命科学》 2005, (3): 200-
科研杂忆:糖皮质激素的快速、非基因组作用
陈宜张
第二军医大学基础医学部,上海 200433


      好的研究工作来自好的设想,而好的设想往往来源于实际中存在的问题。糖皮质激素有快速作用,神经元质膜上是否存在有甾体激素受体,这一问题也是从实际中提出来的。
1 由来
1.1 从下丘脑到应激 1972年,我从西安来到上海*,参加全国针麻学习班,利用上海较好的图书阅览条件,查阅了一些文献,才了解有20世纪60年代末发现的“脑刺激镇痛”其事。“文革”前我们单位有人做过丘脑与针刺镇痛关系的探索,但“文革”中完全停顿。那时,全国从事丘脑与针刺镇痛关系研究的单位很多,而我们原来的基础偏重下丘脑;再则根据已报道的脑刺激镇痛的部位看,下丘脑很可能与镇痛有关。回到西安后,我与教研室同志们商量:是否可以试做下丘脑与镇痛关系这一课题,以后大家就行动起来了。记得在那开会成灾的日子里,我们大家还利用晚上时间在红楼我家的宿舍讨论科研计划,现在回想,热情是可嘉的。按照分工,我做下丘脑与镇痛关系的电生理实验,主要是分析下丘脑对中脑“痛敏”单位的影响等。在镇痛研究过程中,我经常考虑这样一个问题:怎样把下丘脑研究与部队的实际结合起来,以便得到各方面的支持。于是很自然地想到做下丘脑与应激的关系。1980年前后,匈牙利Makara等用经典但很细致的方法证明:发出促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的神经元胞体不在基底内侧下丘脑而在室旁核(PVN) ;接着Vale等阐明了绵羊CRF分子的一级结构。借鉴他们的想法,我们着重分析了PVN与损伤性应激反应的关系。以后文献又陆续报道了PVN与许多调节功能有关,这更增加了我们研究应激反应的浓厚兴趣。
1.2 甾体激素有快速效应 应激文献中有两件事引起了我的注意。一是Ruf与Steiner报道:用微电泳方法向不同脑区给予甾体激素,经极短暂潜伏期即可引起神经元放电的增或减;二是Dallman等发现,糖皮质激素(GC)对CRF的分泌有一个潜伏期短于5min的快速反馈抑制。这两种短潜伏期的快速效应吸引了我。当时徐仁宝教授正在研究GC的胞液受体(GR),即传统意义上的GC受体,我经常向她求教。我觉察到,上述的快速反应很难用传统的甾体激素作用的基因组机制解释,因为通过基因组所产生的作用不可能来得那么迅速。详细阅读文献后又得知:一些内分泌学家早在20世纪60~70年代注意到,雌激素能与子宫细胞膜特异结合,两栖类卵母细胞膜上有孕酮受体,但这些工作未很好继续。在神经元方面,有人曾观察到,雌激素可引起下丘脑神经元超极化,但他们并未深究该反应与传统受体理论的矛盾。我有一点生理基础,又接受了受体理论的启蒙,就跃跃欲试地想在神经元质膜上论证一下GC膜受体(mGR)的问题。这个问题是重要的,如果mGR确实存在,从神经生理学看,甾体激素将可能是一类新的调质(modulator) ;从内分泌学讲,将是对传统的基因组机制的重要补充。这种想法的确是一种大胆的奢望。
2 发展
      我们的研究不可避免地直指GC作用的三个特征:第一,它是快速的;第二,如此快速,它很可能不通过基因组,即它是非基因组的;第三,它很可能作用于细胞的质膜,而不是细胞核。我们的mGR研究始于1985年,1987年将有关实验结果分别在三个国际性学术会议上进行交流,提出了快速、非基因组的机制,以及膜受体的问题[1]。当时,这些问题并未引起人们的注意,倒是有人听后耸耸肩,意有保留。
2.1 实验设计须缜密而又刻意求新 友人曾告诫我:“做科研要注意驾轻就熟”。我有一些生理学基础,既然想做mGR问题,那就先用生理方法试一试吧!要试,先得掌握离体神经元的细胞内记录技术。为此,1985年暑期,我从合肥请马如纯教授来沪,以后研究生华少莹又专程去合肥学习。技术掌握之后还有如何精心设计实验的问题。华少莹提出,让GC与牛血清白蛋白(BSA)作共价键结合,然后令GC-BSA分子作用于神经元,在短时间内结合的GC不会进入细胞内。这样应能比较合理地说明:GC作用于神经质膜的外表面[2]。英国神经生化学家Tipton来访,表示对我们工作很感兴趣,但他同时又提出,是否应考虑做乙醇、胆固醇的对照实验。以上的考虑都被列入到我们的实验设计中。
      用纯净的膜制备做结合实验。我们认识到,单凭电生理实验难以深入阐明mGR的作用问题,生化手段的介入是必须的。我首先注意物色人才,其方法之一便是从具有生化基础的硕士生中招收博士生。郭佐同志的硕士论文题目是GCR的半寿期。他考上博士生后,我们就讨论用膜制备做GC结合的测定问题。一开始我们就给自己提出了严格的要求:必须制成一种膜制备,它的胞液污染为零。因为GR存在于胞液,膜制备的任何轻微污染,将会使得测出来的结合位点可能不代表膜上的mGR,而实为污染的GR。我们终于找到了一种彻底排除胞液污染的突触质膜(SPM)标本。以乳酸脱氢酶(LDH)为胞液的标志酶,我们的SPM测不出任何LDH活力。这种比较理想的SPM制备为以后我们的生化工作打下了良好基础。利用这种SPM,我们研究了mGR的一些理化特性。根据这些特性判断,mGR与GR有很大的差异[3~4]。
2.2 能否用形态学方法来证明? 自从胶体金免疫电镜技术问世以来,不少研究者用来研究受体问题,取得新的成果,如证明了乙酰胆碱受体位于肌细胞膜的外表面。我们当时获悉已有多种GR的单克隆抗体问世,如果某种单抗同时也能辨认mGR的话,我们应能用形态学方法来检验神经元质膜上有无GR样抗原的存在;如有,它很可能就是mGR或其近似物质。我们虽有制备纯净SPM的基础,但对电镜技术却毫无经验。于是就向鞠躬教授请教,他又介绍一位博士生协助我们。在他们的指导和帮助下,傅红同志获得了存在于SPM标本神经元膜外表面上的清晰金颗粒电镜照片。颗粒附着于突触前及突触后膜的突触外区。这种分布符合于mGR起作用的特点,即它可接受来自血循环的激素而不仅仅是非突触前末梢分泌的物质[5]。
2.3 糖皮质激素影响神经元的分泌和重摄取 GC影响神经元的膜电位,也就是GC对神经兴奋性的影响,因为膜电位的变化必然会影响神经元兴奋的阈值,但GC对神经元的影响,是否只限于兴奋性变化呢?我提出了把快速、非基因组的作用研究扩展到神经元功能的其他方面,后来也取得了可喜成绩。
      首先,我考虑到GC对神经元分泌递质或调质的影响。美国有一个实验室,早就报道过孕激素能快速影响神经元释放多巴胺。我们设想,GC在神经内分泌反馈调节中有快速作用,它应该可以调节CRF或AVP的释放。为此,在我的提议下,王春安教授花了不少的精力,建立了孵育离体脑薄片的方法,以测定它所释放的肽含量。由于CRF比较昂贵,我们选用了AVP作为测定对象。刘秀在此基础上继续推进了这项工作,并且提出很好的建议,例如在放线菌素及放线菌酮作用下来观察GC的快速作用并完成了实验。结果证实了我们的预想:GC可以快速地以非基因组机制抑制AVP自下丘脑薄片的释放。刘秀的论文很快在国际杂志上发表[6~7]。
      GC是否会快速影响其他类型的神经分泌过程呢?宋玲在前人工作的基础上,研究了GC对原代培养肾上腺嗜铬细胞分泌儿茶酚胺的影响。结果是肯定的,GC能够抑制由乙酰胆碱、毒蕈硷、尼古丁及高钾刺激所引起的儿茶酚胺的分泌,而且有趣的是,GC也抑制由以上四种激动剂所引起的细胞内Ca2+的升高[8]。
      然后,我们又想到GC对神经元另一个基本活动过程,即对神经元递质的重摄取的影响问题。诸秉根比较系统地研究了GC对神经元突触体、神经细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞重摄取谷氨酸的影响,结果发现GC可以快速促进谷氨酸的重摄取,而且具有甾体特异性,其最低有效浓度可达生理浓度的10-8M以下[9]。
2.4 提出的问题比解决的问题还要多 1988年,丹麦科学院院士N.A.Thorn来访,看到我们的结果喜形于色,原来他有一项实验结果在欧洲的一个会议上交流,因得不到解释而被质疑。他们发现,与下丘脑已断离的垂体后叶神经末梢有摄取抗坏血酸的能力,而这一摄取可被皮质激素所抑制。神经末梢既已与胞体脱离,基因组机制当然无从发挥作用。我们的结果则可以从膜受体方面作出某种解释。1989年,我们在赫尔辛基第31届国际生理学大会的一个专题讨论会上报告了结果,怀疑论调似乎不见了。几年来国际上研究甾体激素膜受体或快速作用的实验室日渐增多,也有很突出的进展,如已经知道两栖类脑的细胞膜上有与GC相结合的受体,结合受GTP的调节,提示GC对膜的作用可能与G蛋白有关。
      我们常有遐思:对于mGR,我们似乎已经知道了一点什么;但仔细推敲,感到新冒出来的问题很多,甚至比已经解决的要多。我们可以发问:(1)膜上的GC结合位点是否就是实现电生理效应的分子?(2)mGR只有一种吗?(3)甾体激素引起神经元电位变化与哪几种离子有关?(4)膜受体介导的电生理效应是否需要第二信使?哪一种?(5)mGR的生理功能是什么?膜效应与基因组效应之间是否有关系?等等。
      甾体激素膜受体是一个新问题,每当我们获得点滴资料时,经常希望与其他人的结果进行对比,仅供参考;但常常不易找到合适的资料。一个科学事实要令人接受,当然会遇到种种考验与批评,但应当作出答复。事实上,不论是技术细节还是基本原理方面,都有不少陷阱在等着我们,例如:(1)膜上的东西一定是受体吗?会不会是其他机构,例如转运子。(2)甾体是否可能以另一种方式起作用,例如先进入细胞膜内,从膜的内侧面起作用,或先与另一物质相结合,然后再起作用?(3)避免了胞液的污染,是否也同时排除了核碎片的污染?(4)在用SPM作结合测定时,杂蛋白的影响如何?等等。
3 从寻找膜受体转向细胞内信号转导研究
3.1
 膜受体 毫无疑问,寻找并克隆mGR对我们的工作具有极重要的意义。1994年,邱俭从江西来报考我的研究生,在复试空隙,他旁听了我们在病理生理教研室的一个小型学术讨论会,会后他侃侃而谈,说应如何如何克隆GC受体。其实这一工作已由傅红在复旦大学谢毅教授指导与合作之下进行。后来傅红出国,邱俭入学后就接着在复旦大学为克隆GC膜受体而苦战,当时根据我们的种种实验结果,是把GC膜受体作为一种G蛋白耦联受体(GPCR)来设计和克隆的。
经过傅、邱两人前后两年多的努力,克隆GC膜受体未获成功。1997年我有幸在圣彼得堡与美国Moss教授共同主持了第33届国际生理学大会的“甾体激素的非基因组、快速作用”专题讨论会,我们报告的是关于GC引起的细胞内信号转导,而不是受体克隆。
3.2 细胞内信号转导 对GC的快速、非基因组机制来说,另一重要的问题是GC通过什么样的细胞内机制达到上述效应?我们已获得了重要证据,表明PKC及PKA参与这一过程。娄淑杰和邱俭发现:GC对PC12细胞株儿茶酚胺的分泌有快速抑制作用,其结果与原代培养嗜铬细胞上的相似,GC也能抑制高K+和缓激肽引起的细胞内钙上升。有趣的是,PKC可能参与这一过程[10]。除嗜铬细胞瘤外,在其他种类的神经或神经胶质细胞系上也看到了类似现象。有的细胞不是通过PKC,而是PKA[11]。在GC促进神经元摄取谷氨酸的实验中,我们也发现GC的促进作用需要有G蛋白的参与。
在研究GC快速调制细胞内Ca2+浓度变化,调制儿茶酚胺分泌的研究中,我们已确信,GC通过快速激活细胞内蛋白激酶C,从而达到调制作用,邱俭还直接从检测PKC活性加以证实[12]。总结这一阶段工作,我和邱俭接受Mol Cell Biol Res Commum的邀请,写了一个有关的综述[13]。
以后邱俭又提出,可以研究PKC的下游,即对MAPK的激活。三种主要的MAPKs:ERK、JNK、p38,我们都做了;也用了不同的细胞,包括原代培养海马神经元;都有很好的结果。从激光共聚焦荧光显微镜术得知,激活的MAPK转位到了细胞核[14~16]。以此为基础,2000年于Houston举行的中美医学论坛上我作了一个报告,提出非基因组作用有可能引发一个新的基因组作用。这一材料由News Physiol Sci约稿并刊登[17],这是国际上提出最早的几个见解之一。
4 非基因组机制的复杂性
      最近十几年来我们陆续看到:差不多所有甾体激素都有非基因组作用。就每一个甾体激素而言,其作用模式多种多样,作用部位可以在细胞膜、在胞液、在内质网;传统受体拮抗剂对它的作用,有的可以阻断,有的却不能阻断。糖皮质激素的情况也不例外。这一现象促使我考虑,糖皮质激素非基因组作用可能并非一种匀质的过程,因而对于介导这一作用的“受体”问题,应作更为审慎地考虑。虽然2003年和2005年Proc Natl Acad Sci USA和Science均已分别报道,克隆到孕激素膜受体和雌激素膜受体,而且都是GPCR。但是GPCR有跨膜七次特点,甾体激素何以既能与GPCR作用,又能与经典甾体激素受体相互作用,从分子结构上来看,仍然是一个问题。为此,2005年4月在杭州召开的一个“非通常方式的受体及信号转导通路激活”的小型讨论会上,我谈了上述看法。
在科研中,当新事物走到你的面前,而你又似乎在接近它的时候,我们的感觉是:如临深渊,如履薄冰!
5 糖皮质激素快速作用有何生理意义?
      这方面也显示出良好的前景。例如有一种含GC的喷雾气溶胶喷入气管—支气管时,可以快速缓解哮喘病人的支气管痉挛,这很可能就是GC快速非基因组作用在临床上的验证。我们确信:随着新假说的确立,在实践上将会发现更多的应用实例。事实正是这样,近年来由蒋春雷教授所领导的研究工作正在比较深入地证实这一设想,已经出现新的进展[18~19]。

[参 考 文 献]
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