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CN:31-1600/Q
ISSN:1004-0374
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《生命科学》 2006, 18(2): 97-
利用模式动物探讨出生缺陷的发生机理
贾顺姬,孟安明*
清华大学生物科学与技术系,北京100084

      出生缺陷一般是指婴儿先天性畸形,因胚胎不正常发育而引起,表现为新生儿在形态、结构、代谢、功能等方面的异常。根据2004年全国妇幼卫生监测结果,围产期的出生缺陷总发生率128.38/万,主要畸形发生率顺位为先天性心脏病(18.53/万)、总唇裂(14.85/万)、多指(趾)(14.61/万)、神经管缺陷(9.44/万)、脑积水(7.92/万);  但是,许多神经系统缺陷(如嗅觉缺失、听力缺失、视神经疾病、先天性痴呆)和先天性心脏病在围产期之后(出生7天后)才容易发现,因此神经系统和心脏出生缺陷实际所占的比重可能比围产期的统计结果要高许多。这些出生缺陷给家庭和社会带来了巨大的精神压力及经济负担,而且直接影响着民族的兴旺和繁荣,必须加以解决。
      胚胎发育是一个非常复杂的过程,受到十分精密的遗传调控,也受到环境的影响。胚胎发育的遗传调控涉及数以百计的基因,这些基因的任何一个丧失功能或发生异常,都可能引起胚胎的异常发育,导致胚胎的死亡或发生组织器官缺陷。降低出生缺陷的根本途径在于基于遗传检测的早期预防,但目前对胚胎发育的分子调控机理知之有限,还无法实现全基因组水平上的遗传检测。因此,研究胚胎发育的分子调控机理,可望为预防和早期诊断遗传性出生缺陷积累数据和提供新的手段。
1 神经系统和心脏的发育与疾病
      神经系统由外胚层细胞分化形成[1]。在原肠作用末期,预置神经外胚层细胞增殖、中部内陷、外侧隆起并最终在背部中线融合形成中空的神经管(神经管畸形就是指神经管在某些区域的闭合失败)。神经管形成后,沿前后轴线分化为头区和脊髓区,头区再分化为前脑室、中脑室、后脑室,每个脑室将再分化出不同的区域。在模式动物上的研究表明,原肠作用期外胚层中的神经外胚层命运主要决定于背部组织中心产生的信号,如Chordin、Noggin、Follistatin等,它们拮抗腹部化信号BMP4。神经外胚层中线的内陷可能首先是受脊索前体细胞产生的Shh信号诱导,胞外基质蛋白,如E-Cadherin等可能与神经外胚层细胞的迁移和神经管的闭合有关。在模式动物上发现,头部的正常形成需要抑制Wnt、FGF和Nodal信号。事实上,已经发现人的一些神经管缺陷和脑室发育缺陷确实与上述信号通路的缺陷有关,如某些前脑无裂畸形(Holoprosencephaly)是由于SHH或其下游调节因子PATCHED、GLI2、GLI3或SIX3的突变所致,有的是由于Nodal信号介导因子,如CRIPTO、FAST1的突变所致[2~3]。各脑室和躯干神经管形成后,将沿不同的轴线形成各种神经元,神经元的轴突向不同的靶组织定向生长,最后形成一个中枢神经网络,协调机体各部分的功能并对外部刺激发生反应。神经系统的分化是一个复杂的过程,同样受多个信号通路的影响,例如躯干运动神经元受来自腹部的Shh信号诱导而受来自背部的BMP信号抑制,但许多具体的分子机制还很不清楚。神经系统分化的异常引起各种各样的神经疾病,如智力发育不全、癫痫、肌无力等等。
      人的面部形成主要受头部神经嵴细胞的影响。神经嵴细胞起源于预置神经板的外侧边缘,在神经管闭合时位于闭合处,随后离开闭合处向特定部位迁移。头部神经嵴细胞用于形成头部和颈部的骨、软骨、结缔组织、神经元等。来自前脑和中脑的神经嵴细胞迁移进入神经管下方的上颌骨突起(上颌骨原基)中,来自中脑和后脑的第1、2菱脑原节的神经嵴细胞迁入下颌骨突起(下颌骨原基)中,上、下颌骨原基中的神经嵴细胞大量增殖、分化,位于中线两侧的原基向中线生长而最后融合形成上、下颌骨。两侧上、下颌骨原基在中线汇聚的失败是导致唇裂或腭裂的主要原因,这种汇聚失败涉及神经嵴细胞形成、迁移路线、在颌骨原基中的增殖和分化等方面的异常。在模式动物上的研究发现,Wnt、BMP、FGF、Shh等信号通路均可影响头部神经嵴细胞的形成、迁移和分化。目前已鉴定出TGFa、TGFb3、RARa、SHH、PAX9、RUNX2、COL2A1、MSX1、MSX2等基因发生突变的唇腭裂[4~5]。周边神经系统(如感觉神经元和交感神经系统)均由头部和躯干神经嵴细胞分化产生,相关的发育疾病包括耳聋、感觉缺失、白化病等等。
      心脏起源于侧板中胚层,生心中胚层细胞命运受内胚层来源的BMP和FGF信号诱导,但受外胚层来源的Wnt信号的抑制。在原肠作用过程中,两侧的生心中胚层细胞迁移至亨氏节(Henson{$39}s node)前融汇形成一条生心管,随后心管延伸、膨胀并弯曲,心室、心房形成,然后分别向不同方向移动并开始跳动,心内膜垫组织等形成,最后心内膜垫分化为各种瓣,保证血液单向流动,心肌膜增厚,最终形成心脏。在心脏发育过程中,FGF和BMP信号首先激活转录因子Nkx2.5的表达,然后激活Gata4、Gata6、Mef2、Tbx5等转录因子的表达,这些转录因子再激活其他心脏特异性基因的表达[6~7]。在果蝇中,Nkx2.5的同源基因tinman的突变使胚胎不能形成背部血管(相当于脊椎动物心脏)[8];   小鼠Nkx2.5基因的突变导致生心管不能弯曲[9];  人NKX2.5基因突变导致先天性心脏病。其他相关转录因子的缺陷也会导致心脏发育缺陷[10]。
2 利用模式动物研究出生缺陷发生机理的必要性
      无论是神经系统、心脏或是其他组织器官的发育,都涉及多个遗传信号通路,而每个信号通路又涉及数十、上百个不同的基因,因此有关的出生缺陷往往表现为多基因性(即遗传异质性)。直接鉴定引起人出生缺陷的基因本质,无疑会为孕前和妊娠早期(如2周内)检测和干预提供有效手段,从而降低出生缺陷率。然而,直接对人的出生缺陷进行遗传研究受到以下因素的限制:(1)目前家庭的单胎率高,畸形儿的早期死亡率较高,导致待分析的家系小,难以通过连锁分析法进行基因定位;(2)由于同类出生缺陷具有遗传异质性,以及目前对早期组织器官发育的分子机制所知有限,难以用关联分析法(即比较候选基因在散发患者与正常人群中的频率)确定突变基因;(3)由于伦理因素而不能直接对畸形儿进行遗传操作,所以难以确认候选缺陷基因和了解其对其他组织器官发育的影响;(4)在发现致病基因后,也不能直接在人体上进行其发病机理(包括基因间的相互作用或相互关联)的研究和在此基础上进行初步治疗尝试。
      模式动物的应用已有100多年的历史,在生物学研究中具有不可替代的重要作用。大多数生物学过程在长期的进化中是高度保守的,因此,许多生物学过程在大多数或所有的模式生物中都是类似的,模式动物也因此成为研究人类生物学过程和疾病发生的重要工具。模式动物与人的胚胎发育有许多相似之处,特别是脊椎动物和人的胚胎发育过程即使在形态上也相当类似,在分子水平上所涉及的信号通路和基因一般都有高度的同源性。例如,最早在果蝇上发现了影响胚胎前后轴线上组织器官分布的同源异型基因家族(homeotic selector gene family),目前知道其他动物和人的基因组都有该基因家族,其功能也是影响胚胎前后轴线上组织器官分布[11]。再如,第一个心脏发育的关键调控基因tinman是在果蝇上发现的,随后的研究表明其同源基因Nkx2.5同样在人、小鼠、斑马鱼的心脏发生中起关键调控作用。根据引起模式动物胚胎发育缺陷的基因而确定出来的引起人的类似出生缺陷的基因已有很多实例。大量数据显示,人的疾病基因往往能在模式动物中找到相应的基因并发挥同样的功能,将人的致病基因导入模式生物一般产生和人疾病相似的表型,有力地证明了模式动物可以很大程度模拟人的疾病发生。因此,利用模式动物研究胚胎发育缺陷的分子机制具有很大的优势,研究成果也完全可以为预防人口出生缺陷提供理论和技术基础。
      目前最广泛利用的模式动物包括:鼠(哺乳动物模式)、斑马鱼(脊椎动物模式)、爪蟾(脊椎动物模式)、果蝇(无脊椎动物模式)、线虫(无脊椎动物模式)。它们的共同特点是:(1)易于细胞和遗传操作,如转基因、诱变、组织移植等;(2)完备的基因组信息,目前线虫、果蝇、小鼠、斑马鱼的基因组全序列已测出;(3)较高的繁殖力;(4)生长周期短,从单细胞胚胎发育到性成熟一般为几天到3个月;(5)体积小、易于养殖,保证以较少的投入,随时提供充足的实验材料。 各种模式动物还有自身的特点和优势。例如,果蝇用做模式动物已有悠长的历史,对其遗传背景、基因定位与表型效应的认识远胜于其他实验动物,同时有比较成熟的各种遗传分析方法;斑马鱼具有超强的繁殖能力,是目前惟一可以进行大规模随机诱变筛选隐性突变体的脊椎动物,其胚胎透明、在体外发育,可以很容易地观察单个胚胎的连续、动态的发育过程;小鼠是哺乳动物的实验模型,其发病表型及机制都与人的发病过程有很高的一致性,小鼠和人体基因有很高的同源性,是认识和分析人类基因功能和疾病机制不可缺少的环节,而且在小鼠上还可以方便地通过剔除特定靶基因来研究其功能,人类疾病的小鼠模型还是进行新药筛选和治疗方案评价的理想模型。综合利用不同的模式动物,对重要的胚胎发育过程和基因的作用机理进行研究,可以起到取长补短、相互验证的效果。
3 研究发育相关的分子机理的主要策略
      尽管目前已在分子水平上对神经系统和心脏等的发育机制积累了一定的知识,但全面了解这些组织器官发育的基因调控网络还有很长的路要走。例如,Wnt、Nodal、BMP、FGF、Shh信号在胚胎的许多器官发育中都起重要作用,这些信号通路之间还相互影响,但分子生物学研究还在不断地发现这些信号通路的新的介导因子或调节因子,弄清这些新的因子和那些尚待鉴定的因子在各种器官发育中的作用还需要做大量的工作。再如,神经管、头面部和心脏的形成都涉及到细胞的定向运动,而对这些细胞运动的时空特异性的调控机制更是知之极少。由于模式动物和人类器官发育在分子水平上的保守性,加上其取材优势和可遗传操作性,利用模式动物来发现影响这些组织器官形成的新基因,再将相关知识应用到人的出生缺陷的遗传诊断上,在国际上已成为主流策略。
      发现影响特定组织器官形成和分化的新基因的一个最重要途径是选择合适的模式动物进行大规模的人工诱变,以期获得数十、上百的表现型相似但基因型不同的突变体,从突变体中克隆出突变基因后就可以知道该基因的功能,同时该突变体还可用于研究基因间的调控网络。这种从功能到基因的方法被称为正向遗传学方法。在动物上主要的人工诱变方法包括化学诱变、物理诱变和遗传学诱变,化学诱变剂EMU或ENU处理动物主要是引起DNA上单个碱基的突变,物理诱变是利用g-或X-射线处理使染色体缺失,遗传学诱变(如转座子或反转录病毒插入诱变)是通过分子生物学手段破坏基因的编码框。国外在20世纪70年代用化学诱变剂EMU和ENU对无脊椎动物果蝇进行了大规模的突变研究,首次从分子水平上阐明了一些重要的发育分化途径,并在1995年获得诺贝尔奖。20世纪90年代初,国外首次利用化学诱变剂开展了对脊椎动物斑马鱼的大规模诱变研究,获得了数百种不同的突变体,并已克隆了数十个突变基因[12~13];  国外也对小鼠进行了较大规模突变研究,已产生几百种突变体(主要是显性突变)[14~15]。目前一些政府机构(如美国的NIH、英国的MRC、德国的GSF和日本的REKIN)对斑马鱼和小鼠的大规模ENU突变和遗传学诱变研究给予了高强度的资助,还有一些私有公司(如Exelixis、Artemis Pharmaceuticals、Meraid Pharmaceticals、Znomics)也正在投巨资开展这种诱变研究。可见,化学诱变和表型筛选法已成为高通量建立特定人类疾病的动物模型和克隆疾病相关基因的重要方法。通过以上技术,目前国际上已获得数百个人类疾病的动物模型,其中也包括了一些神经系统出生缺陷和先天性心脏病的动物模型。
      发现影响特定组织器官形成和分化的新基因的另一个最重要途径是反向遗传学方法,即先分离出在特定组织器官中表达的基因,再研究它们的功能。利用组织器官分离、差减杂交、原位杂交等技术,可有效分离组织器官或发育阶段特异性表达的基因;利用基因芯片、酵母双杂交、蛋白质组学等技术,则可由点到面,挖掘更多的相关基因。目前在果蝇、斑马鱼和小鼠上已有相当成熟的基因功能研究技术,如转基因、RNAi、反义寡核苷酸抑制、基因敲除等。迄今绝大部分发育相关基因的功能都是通过反向遗传学方法得以阐明的。
      通过不断加深对胚胎发育分子机理的了解,最终将勾画出胚胎发育的基因调控网络及环境的影响,通过对父母的基因筛查、早期胚胎的遗传检测、药物干预等措施,可望更有效地预防出生缺陷的发生。
4 我国利用模式动物研究出生缺陷发生机理的现状及展望
      我国对人口出生缺陷的研究相当重视,建立了全国妇幼卫生监测网,在出生缺陷的地理、人群分布特点及环境对出生缺陷的影响等方面做了大量的工作。近年来,随着各个部门的重视和一批优秀留学人员回国,我国在模式动物胚胎发育生物学领域的研究取得了长足的进展,建立了遗传工程小鼠资源库,通过诱变和基因剔除获得了许多人类疾病的动物模型,也开展了斑马鱼等其他模式动物的诱变和胚胎功能基因组的研究。完全立足国内的相关研究成果已在一些国际著名刊物,如Science、Hepatology、Am J Pathol、J Neurosci上发表[16~19],并获得了一批专利。
       为了加强对出生缺陷的发生机理的研究,2005年国家重点基础研究发展计划资助了“利用模式动物研究遗传性出生缺陷的发生机理”项目,国内近20个实验室正在联合攻关,开展以下方面的研究。
4.1 大规模诱变产生神经系统和心脏发育突变体并定位突变基因 果蝇、斑马鱼和小鼠都适于进行大规模诱变研究,通过ENU诱变技术、转座子插入诱变技术、反转录病毒插入诱变技术创造大量的神经系统和心脏发育突变体,建立起我国自己的出生缺陷模式动物资源库。用果蝇筛选心脏发育缺陷和神经病变的突变体,用斑马鱼筛选头部和心脏发育缺陷的突变体,用小鼠筛选神经系统缺陷的突变体。对这些突变体的表型(包括伴生性其他缺陷)进行详细的分析,并从突变体中克隆突变基因。
4.2 研究神经系统和心脏发育的基因调控网络 利用获得的突变体,检测相关已知基因的表达谱是否发生改变;利用差减杂交、mRNA差异显示、DNA芯片、质谱分析等技术发现在突变体胚胎和正常胚胎中差异表达的新基因;利用酵母双杂交、亲和层析等技术寻找与突变基因编码产物互作的新因子;通过报告基因系统、转基因等途径研究相关基因之间的上下游关系和调控机理。通过这些研究将不断地发现与神经系统和心脏发育相关的新基因、甚至新的信号通路,并不断充实这些信号通路和基因所涉及的调控网络。
4.3 对在早期神经系统和心脏中表达但功能未知基因的功能研究 选择一些在早期神经系统和心脏中表达、可能与TGFb、Wnt和Fgf信号通路相关、而在相关组织器官发育中功能尚不明确的基因,利用基因敲除技术、靶基因选择诱变技术和转基因技术等研究它们的生物学功能;利用有关方法筛选出的新基因(包括人和动物的)也将用这些方法进行研究。这类反向遗传学研究不仅可以阐明基因的功能,从分子水平上更深入地了解神经系统和心脏发育的机理,也将产生许多人类神经系统出生缺陷和先天性心脏病的动物模型。
4.4 分析我国神经系统缺陷和先天性心脏病新生儿的致病机理 收集神经系统缺陷和先天性心脏病新生儿家系样本,选择可引起模式生物神经系统或心脏发育缺陷的基因,通过基因信息学方法查寻人类同源基因,用这些基因作为候选基因,利用关联分析和连锁分析等手段定位相应出生缺陷儿的致病基因。利用差减杂交和DNA芯片等技术,比较正常流产胎儿和死亡畸形胎儿基因表达差异,寻找出在相关组织中特异表达的一些功能未知基因,再在动物上通过突变和转基因等方法研究它们的功能。
综合而言,该项目将充分利用小鼠、斑马鱼、果蝇的取材及遗传操作性的优势,以在我国高发的神经系统缺陷和先天性心脏病为主攻方向,一方面高通量筛选建立出生缺陷的动物模型,发现在神经管形成和分化及心脏发育中起重要作用的新的信号通路和新的基因,深入了解它们发挥功能的分子机制和调控网络,推动我国发育生物学学科的发展;另一方面结合临床样品,分析它们与出生缺陷的关系,从而更全面、系统地认识神经系统缺陷和先天性心脏病的分子基础,为我国的人口出生缺陷研究提供新的理论、检测技术和个性化预防措施,促进我国在人口出生缺陷研究领域与国际前沿接轨,形成能够持续进行创新性研究的能力。

[参 考 文 献]
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