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ISSN:1004-0374
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《生命科学》 2006, 18(4): 309-
“与细胞运动性相关的Nudel\Lis1\dynein通路功能及调节”研究进展
刘丽蓉,朱学良*
中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031
      细胞的运动性与其生命的特征密切相关。胞内物质运输和有丝分裂等重要而复杂的运动过程,与微管及微管依赖性马达蛋白(motor proteins)密切相关[1~3]。这些马达蛋白犹如沿微管“公路”行驶的汽车,负责产生与细胞运动性相关的推拉力量或把各种货物(cargo)运往各地。马达蛋白主要由两 大类组成:胞质dynein驱动向微管负端的运动,而kinesin家族则负责向微管正端的运动。
      胞质dynein本身是一个大的蛋白质复合体,包含两个约550kDa的重链(DHC)、三至四条74kDa的中链、四条约55kDa的中轻链和若干条8~22kDa的轻链[3]。dynein参与了细胞的多种重要生命活动:首先,dynein在有丝分裂中具有复杂的功能,参与核膜破裂、纺锤体组装、染色体运动、纺锤体检查点失活等重要活动[1~2]。纺锤体检查点是细胞周期中的一个重要检查点,由Mad2、Bub1等染色体动粒(kinetochore)蛋白构成,像“传感器”一样能感知微管与动粒结合情况和张力。只有在所有染色体都排列在赤道板上,即染色体动粒与纺锤体微管实现双极连接(bipolar attachment)后,检查点才失活并由此启动姐妹染色单体的分离,从而保证了遗传稳定性[4~5]。一般认为,微管与动粒的结合使得Mad2等检查点蛋白从动粒上消失或减弱的过程与纺锤体检查点失活密切相关。dynein介导动粒检查点蛋白沿微管向纺锤体两极的运输,对检查点失活的机制有重要贡献[6]。第二,dynein为朝向微管负端的细胞内囊泡运动(内吞体、内质网到高尔基的中间体ERGIC等)以及多种膜细胞器(高尔基体、溶酶体等)的组织所必需。第三,dynein还可能参与神经细胞的迁移。因此,DHC突变或缺失的小鼠和果蝇在胚胎发育的早期便会死亡。通常认为,dynein通过另一类蛋白复合物dynactin与需要运输的膜类“货物”(如细胞器)或需附着的着力部位结合,其选择性由dynactin决定。由于dynein结构和功能的复杂性,对其活性的调控机理所知甚少。
      无脑回蛋白Lis1是一个重要的功能蛋白[7~8],剔除该蛋白基因的小鼠在胚胎发育极早期即死亡,细胞也无法存活,因而和dynein一样是一个必需基因。与其他多数基因不同,人类只需要Lis1的一个等位基因突变,使得该蛋白的表达水平降低一半时,即可导致I型无脑回病(Lissencephaly),说明该蛋白的剂量对大脑的正常功能有重要影响。无脑回病患者智力低下,寿命短,多数死于童年期,病理特征为大脑平滑,即缺少可增加大脑表面积的脑回。研究表明,无脑回病主要是神经细胞迁移的缺陷造成的。在脑发育早期,神经元均由位于室区(ventricular zone)的神经干细胞经有丝分裂、迁移和分化而来,最终形成成人大脑皮层的六层神经元结构。所以,神经元前体细胞的正常迁移对其恰当的分化及大脑结构的形成非常重要[9]。近来发现, Lis1是dynein通路的一个成员,而且其调节通路是一个在真核生物中均保守的信号通路[10]。
      在霉菌Aspergillus中,与细胞核在菌丝内的均匀分布有关的蛋白被称作核分布因子(nuclear distribution factor, Nud),其中NudF为Lis1的同源蛋白,可调节霉菌dynein的亚基NudA和NudG等形成的染色体动粒外层,M后期则逐渐从着丝粒处消失,因此,该蛋白质很可能与细胞的有丝分裂过程有关[23~26]。Nudel是作为mitosin结合蛋白被克隆到的[27],并且,它也会被dynein从动粒搬运到纺锤体两极上[28]。这些结果暗示mitosin可能也是Nudel\Lis1\dynein通路的一个组分,深入了解mitosin的功能也将有助于该通路的研究。
      利用载体质粒基础上的RNAi技术,很有效地(>95%)抑制了mitosin的表达。流式细胞检测发现细胞在缺失mitosin的情况下,细胞周期会被阻滞在有丝分裂期,并且凋亡细胞的比例上升。抑制mitosin的表达后,有丝分裂过程中染色体汇聚的速度明显下降,染色体错误排列的比率大大提高,染色单体之间的张力降低。在检查mitosin的缺失对着丝点蛋白组装影响的实验中发现,Mad2和BubR1等检查点蛋白的定位没有明显的影响,而会以微管依赖的方式使微管相关的马达蛋白CENP-E、dynatin/dynein的动粒定位显著下降。利用激光共聚焦显微镜技术,发现抑制mitosin的表达严重破坏细胞纺锤体的形态,而且破坏了微管与动粒的稳定结合。利用活细胞监测荧光标记组蛋白来检查mitosin的抑制对有丝分裂过程中染色体运动的影响,结果发现没有mitosin的情况下,有丝分裂中的染色体很难完全排列到赤道板上,细胞周期会被阻滞在早中期-中期的进程中约2个小时,然后发生细胞凋亡。而染色体的提前解凝集可能是导致凋亡的原因[21]。
      我们利用酵母双杂交与融合蛋白体外结合实验还发现,mitosin的C末端包含2 488~3 113位残基的片段通过两个不同的区域结合ATF4(activating transcription factor- 4),其中一个结合区域是亮氨酸拉链。电泳迁移率转变实验表明,含有不同结合区域的mitosin突变体可以破坏或进一步拖滞ATF4-DNA复合物,提示其中可能存在较复杂的调节关系。同时,双荧光报告实验发现,mitosin过量表达可以抑制ATF4的转录活性,用RNAi技术抑制内源mitosin的表达有相反的效果,提示mitosin对ATF4介导的转录激活起到了负调控的作用。我们推测,作为含多个重复亮氨酸拉链序列的核基质蛋白,mitosin很可能在间期充当一个脚手架,招募ATF4以及其他转录因子,在细胞增殖和分化中发挥一定的作用[22]。
      由于该项研究,我们还应邀参加了有美、英、德、中、瑞士等国的21个单位参加的科研攻关,以研究一个新鉴定的肾病致病基因NPHP6的基本性质。我们提供的实验证据,提示该基因的表达产物可以正调控ATF4的活力[29]。
5 Nudel\Lis1\dynein通路的研究工作展望
      Nudel已被报道作为经典的Lis1/dynein信号通路的一部分参与了大脑皮层发育过程中神经细胞迁移过程。我们将深入研究其参与细胞迁移的分子机理及其相关的分子作用网络。我们还希望能进一步了解Nudel在有丝分裂中的作用机制及其与mitosin的相互关系。此外,Nudel究竟如何调节dynein活力也是一个需要回答的关键问题。
[参 考 文 献]
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