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ISSN:1004-0374
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《生命科学》 2007, 19(2): 114-
哺乳动物PB转座因子研究
吴晓晖
复旦大学发育生物学研究所,上海200433
      人类基因组计划发现哺乳动物体内存在大约30 000个基因,将遗传蓝图的“天书”展示在人们面前[1-2]。我国科研人员为此贡献了1%的测序结果。目前,国际竞争的焦点已经转向如何迅速了解这些基因的功能,从中找出有重大理论意义及经济效益的基因,即功能基因组研究。哺乳动物基因功能研究不仅有助于人类认识自我,具有重要的理论意义,而且疾病相关基因的研究也对发展针对性的预防、诊断和治疗手段具有决定性作用,因而成为世界生物科技产业竞争的焦点。
      遗传学研究是了解基因功能最有效的方法之一。通过在患者及其家属中研究筛选疾病基因可以达到这个目的,我国科研人员也由此发现了突变后可以导致乳光牙[3-4]、短趾症[5]、儿童白内障等[6]疾病的基因,但这种方法通常所需时间长、研究费用巨大,重要的疾病相关基因也可遇不可求。由于社会伦理等方面的限制,许多和人类疾病基因功能相关的基础研究无法在人体直接进行,临床试验也必需先在动物中完成后再在人体验证。因此,在模式动物中研究基因功能是世界生物医学界更为普遍的做法。作为唯一的哺乳类模式动物,小鼠和人有超过99%的基因同源,解剖结构和生理活动与人类基本相同,在分析考察哺乳类基因,尤其是疾病相关基因功能上具有非常重要的地位[7]。
     模式动物遗传学研究方法大致有转基因和基因诱变两类。转基因操作可以在动物基因组中引入特定基因,通过观察该基因表达后引起的表型推测基因功能。除此以外,转基因技术在改造经济动物遗传品质和人类基因治疗等方面也有重要的应用价值。与转基因相比,在动物中诱变基因,从基因突变引起的缺陷来判断基因功能更加直接和可靠。系统诱变基因,通过关注特定表型的改变筛选并分析与重要生命活动过程相关的基因及其相互作用的正向遗传筛选策略已在细菌、酵母、果蝇、斑马鱼等低等生物成功应用,所取得的成就在过去已被授予十多项诺贝尔奖。
      传统小鼠转基因技术直接向受精卵注射线性DNA,获得的转基因个体往往以串联体(concatamer)形式携带多拷贝转基因,对基因功能研究带来一定的干扰[8]。 小鼠中常用的基因诱变方法有化学诱变和基因剔除。化学诱变操作简单、突变率高,但基因定位繁琐[9-10]。基因剔除需要胚胎干细胞培养等环节,技术要求高,时间长、费用大[11],不能适应大规模基因功能研究的需要。由于研究方法的这些缺陷,在过去20多年中,科研人员仅对约10%哺乳动物基因的功能有所了解[12]。
     “工欲善其事,必先利其器”。研究方法的改进和创新可以带来研究的突破。我国科研人员通过坚持不懈地探索,最近发现并建立了可在人和小鼠细胞及小鼠个体中高效快速突变基因的PB转座子系统,使在高等生物中大规模解读基因功能、筛选疾病及重要功能基因成为可能。该技术也为转基因动物提供了全新方法,并为人类基因治疗提供了新的途径[13]。
      转座因子(transposable elements)是一类可以改变其基因组所处位置的遗传因子。人和小鼠基因组40%由转座因子相关序列构成,显示其在进化中的重要作用。自然界中,转座因子与从小鼠毛色发育(AY)到人肌营养不良(DMD)等多种发育和疾病过程有关。在实验室中,转座因子可以用作转基因载体携带基因整合到基因组,也可以用于插入基因导致突变。用转座子插入诱变基因具有效率高、诱变、突变定位简单等许多优点。自从Barbara McClintock在玉米中发现了第一个转座子以来,它们已被用于许多生物的遗传学和基因功能研究。原核生物中用转座因子插入突变发现了微生物致病相关的重要基因。果蝇中用P转座因子进行的转基因和插入突变则是现代果蝇遗传学的基础[14]。P因子的高效转座使得从单拷贝P因子出发进行基因组范围插入诱变成为大规模培育突变品系、系统解读基因功能最有效的方法[15]。目前,90%的果蝇基因已被P因子和PB转座子成功插入诱变。
      哺乳动物缺乏有活性的天然转座因子。人们曾经从鱼的基因组中通过比较系统发生学方法人工复活了SB转座因子,发现其能在培养细胞和小鼠里作用[16]。但是,SB因子的转座效率不高[17],并和其他许多转座因子一样存在过表达抑制的现象,即催化转座反应的转座酶表达量上升时转座效率反而下降[18],给提高转座效率的尝试带来了严重阻碍。同时,SB因子携带外源DNA的能力不强。原始的SB因子长度不到2kb,在此基础上每多携带1kb的外源基因其转座效率下降约30%,使得它无法携带较复杂的结构元件进行转基因或插入诱变筛选[19]。SB因子转座时新插入位点主要集中在原始位点周围,在生殖细胞转座时尤其显著[20]。多拷贝SB因子转座时容易发生染色体缺失和致死性的背景突变[21]。这些都妨碍其用于大规模插入诱变筛选。最后,SB因子切离时留下的TA重复也使得用回复突变确认基因功能的工作无法进行[20]。由于这些原因,SB因子发明近10年来没有被广泛应用。
      我国科研人员成功改造了来源于飞蛾的PB因子并将其应用于哺乳动物。PB可在人和小鼠细胞株中高效导入基因并稳定表达,为体细胞遗传学研究和基因表达提供了一个高效、便捷的新系统。PB也可用于培育转基因小鼠,具有携带基因容量大,操作简便高效等优点。与传统方法相比,利用PB进行转基因时转基因以类似于内源基因的单拷贝形式整合,转基因载体可同时携带多个基因,转基因整合效率高并可长期稳定表达,转基因整合位点易于确定,并可用非损伤性的可见标记代替PCR等传统方法经济高效地跟踪转基因。 更令人兴奋的是,研究人员发现PB不仅可高效、广谱地插入小鼠基因组并使基因失活,而且其精确切离的特性也可用于复活被插入的基因。科研人员根据PB转座子的这些优点建立了高效小鼠基因插入突变及筛选技术,在不到一年内培育了数百个小鼠突变,使在小鼠等哺乳动物中高效、大规模了解基因功能成为可能,得到了国际生物医学界的广泛关注和高度评价。
生物界存在着几千种转座因子,人基因组的40%由转座因子序列组成[1-2]。但30多年来,人们试图发现能在哺乳动物中高效作用的转座因子却均未成功。PB因子具有许多独特的优点,是哺乳动物基因功能研究不可多得的宝贵工具,也为我们研究哺乳动物转座因子的作用机理提供了难得的机会。研究PB在哺乳动物中高效转座的原因将对许多基本的生物学问题产生深远的影响。转座因子在进化中曾经是活跃的,但在目前的哺乳动物基因组中却大多失活。了解PB转座机理有助于我们了解转座因子在哺乳动物基因组中的作用方式,并可能为哺乳动物基因组稳定性研究提供启示。P因子等许多转座因子在天然宿主以外的生物中没有活性,表明可能有宿主细胞提供的物质(“宿主因子”)参与了转座过程[22]。PB可以在涡虫、疟原虫、昆虫、小鼠和人细胞中转座,提示它可能不需要物种特异的宿主因子。转座因子编码的转座酶是转座过程的关键催化蛋白。与我们对酶促反应过程的一般认识相反,哺乳动物中不活跃的转座因子编码的转座酶常有过表达抑制现象,它保证了转座反应的活性被限制在不显著危害宿主细胞存活的水平,在进化中非常重要。PB是否也有过表达抑制?其本质是什么?对这些问题的研究不但能揭示这一异常现象的理论基础,而且可能会为解释转座因子在进化中失活的原因提供帮助。如前所述,PB能在分子水平上精确切离,从而可用于培养回复突变,确认基因功能。PB转座时也倾向于插入破坏基因。这些独特的优点导致PB成为基因功能研究的高效工具,但其原因仍不清楚。比较PB转座酶(PBase)和其他转座酶的结构将可能帮助我们了解PB和其他转座因子作用机制的这些差异性。
      另一方面, 对PB转座机理和不同动物中转座行为的深入了解将可以帮助我们更好地利用PB转座因子为哺乳动物基因功能研究服务。例如,大鼠是生理学、医学、药学、营养学和神经科学研究中应用最多的动物模型。大鼠研究的历史悠久,是最早被驯养用于科学研究的哺乳动物。作为实验动物,大鼠有许多得天独厚的优势。大鼠基因组和人具有90%的直系同源基因(orthologues),较小鼠(80%)和人更接近[23]。大鼠身体结构与多种生命活动和人更加类似。大鼠乳腺癌和人类乳腺癌都与肿瘤病毒无关,其转移也首先通过淋巴系统,而不是血液循环过程。大鼠较大的体型更便于进行细致的生理学研究和测量。在行为学等神经科学研究中,大鼠更容易训练,其较大的脑也能更方便和精确地接受手术或测量。由于这些长处,大鼠被广泛用于肿瘤、糖尿病、心血管疾病、精神疾病、损伤和修复、器官移植等各种研究。同时,它还是研究药物代谢、评价药物毒性最主要的动物模型。但是,由于大鼠缺乏实用的遗传分析方法,最近几十年来,它在生物医学研究中的重要地位受到了小鼠的挑战。大鼠转基因整合率和成功率都较低[24]。同时,大鼠不能象小鼠那样通过胚胎干细胞的培养和改造获得基因剔除动物。由于这些限制,在大鼠中通过人工诱变基因研究其功能的工作极其罕见。如能在大鼠中利用PB转座因子建立高效的基因诱变和转基因分析方法,将极大地促进相关生物医学领域,如生理学、药理学、营养学、肿瘤学和神经科学等的发展。又如,基因治疗需要目的基因在细胞中的高效、长期、稳定表达。作为一种能整合在基因组中的非病毒载体,PB因子允许携带的基因稳定表达,因而是很有吸引力的基因治疗候选载体之一。PB因子携带较大插入片段的能力也有助于基因治疗的开展。对PB因子的相关研究将可望对人类疾病的预防与治疗产生重要影响。
      总之,对哺乳动物PB因子的研究不仅可以帮助我们了解哺乳动物转座子的生物学知识,而且可以促进哺乳动物基因功能研究、生物医学和生物技术的发展,具有非常重要的意义。
 
 
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